Herpesviruses are masters of co-evolution, often borrowing or mimicking genes and sequence motifs from their hosts to efficiently interfere with cellular processes. Protein phosphorylation is an essential mechanism of cellular signal transduction, which is particularly exploited by herpesviruses. All eight known human pathogenic herpesviruses encode conserved protein kinases (CHPK), which can phosphorylate a variety of viral and host proteins and play an important role in antiviral therapy. The CHPK of β- and γ-herpesviruses share structural and functional similarities with cellular cyclin-dependent kinases (CDK). However, unlike CDK, CHPK are considered constitutively active because they lack sequence regions important for regulation by cyclins or CDK inhibitors (CKI). This work attempts to use quantitative proteomic analyses to dissect the cellular interactome of clinically relevant CHPK to draw conclusions about their regulatory functions. All analyzed CHPK showed interactions with central regulators of cellular transcription and replication. The β-herpesviral kinases also interact with players in cell cycle control and the DNA damage and repair complex. Particularly, interaction with cyclin A-CDK complexes represents a specific signature of β-herpesviral CHPK. A highly conserved RXL/Cy motif mediating binding to cyclin A was identified in the non-catalytic N-terminal domains of CHPK from human herpesviruses 6 and 7 and from rodent cytomegaloviruses. This RXL/Cy motif was found in partial sequence overlap with a nuclear localization motif (NLS) that was also conserved. Using point mutations that specifically disable either RXL or NLS function, we demonstrated in a murine cytomegalovirus (MCMV)-based infection model that cyclin A binding and NLS function of the MCMV kinase M97 are mutually exclusive as a result of competitive binding. Thus, virus-induced cyclin A expression leads to stoichiometric complex formation of M97 and cyclin A, the subsequent masking of the M97 NLS as well as redistribution of M97 and cyclin A from the nucleus to the cytoplasm. This mechanism allows a dynamic change in the localization and substrate spectrum of the viral kinase. Furthermore, the withdrawal of cyclin A from the nucleus establishes viral inhibition of cellular DNA synthesis. Thus, β-herpesviral M97 kinase performs both CDK- and CKI-annotated functions and contributes considerably to viral growth in MCMV infection. This work represents the first comprehensive analysis of the interactome of CHPK and highlights their importance as key regulators of herpesviral infection. Furthermore, the physiological relevance of the complex interplay between a viral kinase and cyclin A, an essential component of the cell division cycle, was demonstrated.
Herpesviren sind Meister der Koevolution, welche vielfach Gene und Sequenzmotive ihres Wirtes entlehnen oder nachahmen, um zielgerichtet und effizient in zelluläre Prozesse einzugreifen. Die Phosphorylierung von Proteinen ist ein essenzieller Mechanismus der zellulären Signaltransduktion, der von Herpesviren in besonderem Maße genutzt wird. Alle acht bekannten humanpathogenen Herpesviren kodieren konservierte Proteinkinasen (CHPK), welche eine Vielzahl an Virus- und Wirtsproteinen phosphorylieren können und die eine Schlüsselrolle in der antiviralen Therapie spielen. Die CHPK der β- und γ-Herpesviren weisen strukturelle und funktionelle Ähnlichkeiten mit zellulären Cyclin-abhängigen Kinasen (CDK) auf. Im Unterschied zu CDK gelten die CHPK jedoch als konstitutiv aktiv, da ihnen die Sequenzabschnitte fehlen, welche wichtig für die Regulation durch Cycline oder CDK-Inhibitoren (CKI) sind. Diese Arbeit versucht mit Hilfe quantitativer, proteomischer Analysen das zelluläre Interaktom klinisch relevanter CHPK aufzuschlüsseln, um Rückschlüsse auf ihre regulatorischen Funktionen zu ermöglichen. Dabei konnte gezeigt werden, dass allen analysierten CHPK die Interaktion mit zentralen Regulatoren der zellulären Transkription und Replikation gemein ist. Die β-herpesviralen Kinasen interagieren darüber hinaus mit Akteuren der Zellzykluskontrolle und des DNA-Schadens- und Reparaturkomplex. Insbesondere die Interaktion mit Cyclin A-CDK-Komplexen stellt eine spezifische Signatur der β-herpesviralen CHPK dar. In den nicht-katalytischen N-terminalen Domänen der CHPK aus den humanen Herpesviren 6 und 7 sowie aus Nagercytomegalieviren konnten ein hochkonserviertes RXL/Cy-Motiv identifiziert werden, das die Bindung an Cyclin A vermittelt. Dieses RXL/Cy-Motiv wurde in partieller Sequenzüberlappung mit einem ebenfalls konservierten nukleären Lokalisationsmotiv (NLS) vorgefunden. Mit Hilfe von Punktmutationen, welche spezifisch entweder die RXL- oder die NLS-Funktion ausschalten, konnten wir in einem auf murinen Cytomegalievirus (MCMV)-basierenden Infektionsmodell zeigen, dass sich Cyclin A-Bindung und NLS-Funktion der MCMV-Kinase M97 infolge kompetitiver Bindung gegenseitig ausschließen. So führt die virusinduzierte Cyclin A-Expression zu einer stöchiometrischen Komplexbildung von M97 und Cyclin A, einer daraus resultierenden Maskierung des M97-NLS und Umverteilung von M97 und Cyclin A vom Zellkern in das Zytoplasma. Dieser Mechanismus ermöglicht einerseits einen dynamischen Wechsel der Lokalisation und des Substratspektrums der viralen Kinase, andererseits begründet der Entzug von Cyclin A aus dem Zellkern die virale Hemmung der zellulären DNA-Synthese. Somit führt die β-herpesvirale M97-Kinase sowohl CDK- wie auch CKI-typische Funktionen aus und trägt in der MCMV-Infektion deutlich zum Viruswachstum bei. Diese Arbeit stellt die erste umfassende Analyse des Interaktoms der CHPK dar und unterstreicht ihre Bedeutung als zentrale Regulatoren der herpesviralen Infektion. Darüber hinaus konnte die physiologische Relevanz des komplexen Zusammenspiels zwischen einer viralen Kinase und Cyclin A gezeigt werden, einer essenziellen Komponente des Zellteilungszyklus.
