Objective: To evaluate factors regulating craniofacial morphologies and bone mass by investigat-ing high bone mass disorders (eg. autosomal recessive osteopetrosis, dysosteosclerosis, cranio-frontonasal syndrome, and osteosclerotic metaphyseal dysplasia) and their genetic defects on a molecular level. Methods: Next Generation Sequencing was performed on patient DNA, bioinformatic filtering was used to decipher new disease-causing mutations in a group of patients. Sanger sequencing was used to confirm the variants. Patient cells – osteoclasts, mesenchymal stem cells, and osteo-blasts – were grown in cell culture. Protein and RNA were extracted with Radioimmunoprecipita-tion assay (RIPA) buffer and Trizol lysis respectively. Immunoblot assays, cDNA sequencing, and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) were performed to analyze the ef-fect of the mutation on protein- and RNA levels. Osteoclasts were grown, stained for Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP), and visualized by fluorescence microscopy. A resorption assay was performed to illustrate the resorption behavior of mutated osteoclasts. Results: Two novel mutations in the Solute Carrier Family 29 Member 3 (SLC29A3) gene and one new splice-site mutation in the T-Cell Immune Regulator 1 (TCIRG1) gene were found in pa-tients with moderate autosomal-recessive osteopetrosis. Four new mutations in the Ephrin-B1 (EFNB1) gene were depicted in an Indian cohort of non-consanguineous individuals with cranio-frontonasal syndrome. In a patient suffering from osteopetrosis and severe osteonecrosis of the jaws, we described the fourth mutation in the Leucine-Rich Repeat Kinase 1 (LRRK1) gene known to date. LRRK1-mutated osteoclasts showed shallow resorption pits and ineffective bone resorp-tion. Conclusion: We could broaden the spectrum of high bone mass disorders as well as of the disease entity of craniofrontonasal syndrome by the detection of new disease-causing mutations and the description of the resulting molecular effects. In the future, this can facilitate diagnosis and reveal new potential molecular targets for the therapy of osteoporosis.
Fragestellung: Analyse von genetischen Einflüssen auf Skelettentwicklung und -homöostase durch Untersuchung der seltenen genetischen Erkrankungen kraniofrontonasale Dysplasie, auto-somal-rezessive Osteopetrose, Dysosteosklerose und osteosklerotische metaphysäre Dysplasie. Darstellung der Auswirkungen der gefundenen genetischen Veränderungen auf zellulärer und mo-lekularer Ebene. Methoden: Patienten-DNA wurde mittels Next Generation Sequencing dechiffriert und bioinfor-matische Filtermethoden wurden verwendet, um neue krankheitsbedingende Mutationen bei Pati-enten mit den verschiedenen Erkrankungen mit erhöhter Knochendichte zu detektieren. Mittels Sanger Sequenzierung wurden die Varianten bestätigt. Patientenzellen – Osteoklasten, mesen-chymale Stammzellen, und Osteoblasten – wurden in der Zellkultur gezüchtet. Protein- und RNA-Extraktionen wurden mit RIPA-Puffer bzw. Trizol durchgeführt. Durch funktionelle Analysen mit Western Blots, cDNA-Sequenzierungen und RT-PCR wurden die Effekte der Mutationen auf Pro-tein-, cDNA- und RNA-Ebene analysiert. Osteoklasten wurden aus perpipheren mononukleären Zellen differenziert, mittels tartartresistenter saurer Phosphatase (TRAP)-Aktivität angefärbt und durch Fluoreszenzmikroskopie visualisiert. Ein Resorptionsassay wurde durchgeführt, um das Resorptionsverhalten von Osteoklasten darzustellen. Ergebnisse: Zwei neue Mutationen in dem für den Nukleosidtransporter 3 kodierenden Solute Carrier Family 29 Member 3 (SLC29A3) Gen und eine neue splice-site Mutation in dem T-Zell-Immunregulator 1 Gen (TCIRG1) wurden bei Patient*innen mit moderater autosomal-rezessiver Osteopetrose gefunden. Bei vier nicht-konsanguinen indischen Patientinnen mit kraniofrontonasa-ler Dysplasie konnten vier neue Mutationen Ephrin B1 Gen (EFNB1) bestätigt werden. In einem unter Osteopetrose und schweren rezidivierenden Kiefernekrosen leidenden Patienten haben wir die vierte weltweit beschriebene Mutation in dem Leucin-rich repeat kinase 1 (LRRK1) Gen nach-gewiesen. LRRK1-mutierte Osteoklasten zeigten abgeschwächtes Resorptionsverhalten, flachere Resorptionspits und eine ineffektive Knochenresorption. Schlussfolgerung: Im Rahmen des Spektrums von Erkrankungen mit erhöhter Knochenmasse und des Krankheitsbildes der kraniofrontonasalen Dysplasie konnten wir neue krankheitsbedin-gende Mutationen finden und die Effekte auf molekularer Ebene darstellen. Zukünftig kann dies die Diagnostik von seltenen Erkrankungen mit erhöhter Knochendichte erleichtern und langfristig neue molekulare Ansatzpunkte für die Osteoporosetherapie aufzeigen.
