Nitrate (NO3-) and potassium (K+) absorbed by plant cells are carried throughout the plant via short-distance distribution (cytoplasm to vacuole) and long-distance transportation (root to shoot). These two pathways jointly regulate the content of NO3- and K+ in all higher plants. The Arabidopsis thaliana transporter NRT1.5 is responsible for the loading of NO3- and K+ from the root cytoplasm of pericycle cells into the xylem vessels, facilitating the long-distance transport of NO3- and K+ through the roots to the shoots. In this work, the amino acid sequence analysis of NRT1.5 unveiled a low conservation between the NRT1 family members in motifs and residues involved in nitrate and proton transport, suggesting and supporting the diverse substrate specificity of the transporter. Phenotypical analysis of nrt1.5 knockout mutant demonstrated that NRT1.5 is important for the root growth in dependency on external potassium, nitrate, and pH availability. How NRT1.5 is involved in the control of the root architecture in nutrient availability and pH-dependent manner is discussed as a direct or indirect influence of interaction with other cellular components. The bimolecular fluorescent complementation in tobacco plants was used to verify the NRT1.5 interactions at the plasma membrane. Proteins related to pH homeostasis (AHA2), vesicle traffic (PEP12 and VAMP722), calcium-regulated phosphorylation (CBL3 and CIPK23), and anion homeostasis (SLAH1 and SLAH3) were identified. Gene expression of AHA2, CBL3, PEP12, SLAH1, SLAH3, and VAMP722 were affected by low nutrition supply in the nrt1.5 mutant, evidencing a molecular correlation between NRT1.5 and the interaction partners. The nrt1.5 knockout mutant showed several phenotypes under K+ and NO3- deficiencies regarding leave senescence and alteration of the root architecture. The cbl3, pep12, slah1, slah3, and vamp722 knockout mutants and the double mutants with nrt1.5 did not show phenotypes evidencing any biological interaction with NRT1.5. The understanding of the physiological roles of the interaction partners of NRT1.5 in potassium and nitrate homeostasis has been challenging due to the high redundancy of all candidates in their pathways. However, the H+-ATPase AHA2 together with NRT1.5 were capable to affect K+ loading to shoots, modulate the root architecture, alter the extracellular pH, and plasma membrane potential. Also, from the 11 members of H+ ATPase, the AHA4 and AHA6 were up-regulated under K+ and NO3- deficiencies. However, the lack of both NRT1.5 and AHA2 play a critical impact in the expression of all 11 members, leading to an alteration in the control of extracellular pH at K+ and NO3- deficiency conditions. A cellular role of NRT1.5 and AHA2 interaction is hypothesized, where NRT1.5 activity by its H+ antiporter function might generate a ∆pH in the cytosol that AHA2 may restore at the plasma membrane of root cells. Investigation about the binding sites of NRT1.5-AHA2 interaction demonstrated that a conserved glycine residue in the transmembrane domain 5 of NTR1.5, overlapping in a potential LRR motif, is crucial for the protein-protein interaction. A substitution in this glycine at position 209 into a charged amino acid affected the K+ transport function of NRT1.5 and avoided the interaction with AHA2. Overall, this study unravels that the joint activity and function of NRT1.5 and AHA2 take place in the maintenance of potassium and nitrate homeostasis in plants.
Nitrat (NO3-) und Kalium (K+), die von Pflanzenzellen aufgenommen werden, werden über Kurzstreckenverteilung (Zytoplasma zur Vakuole) und Langstreckentransport (Wurzel zum Spross) durch die Pflanze transportiert. Beide Wege regulieren gemeinsam den Gehalt an NO3- und K+ in allen höheren Pflanzen. Der Transporter NRT1.5 aus Arabidopsis thaliana ist für die Beladung von NO3- und K+ aus dem Wurzelzytoplasma der Perizykelzellen in die Xylemgefäße verantwortlich und ermöglicht so den Langstreckentransport von NO3- und K+ durch die Wurzeln zu den Sprossen. In dieser Arbeit enthüllte die Aminosäuresequenzanalyse von NRT1.5 eine geringe Konservierung zwischen den NRT1-Familienmitgliedern hinsichtlich der Motive und Aminosäurereste, die am Nitrat- und Protonentransport beteiligt sind, was die vielfältige Substratspezifität des Transporters nahelegt und unterstützt. Die phänotypische Analyse der nrt1.5 knockout Mutante zeigte, dass NRT1.5 wichtig für das Wurzelwachstum in Abhängigkeit der externen Kalium-, Nitrat- und pH-Verfügbarkeit ist. Wie NRT1.5 an der Kontrolle der Wurzelarchitektur in Abhängigkeit der Nährstoff- und pH-Verfügbarkeit beteiligt ist, wird im Zusammenhang mit dem direkten oder indirekten Einfluss der Interaktion mit anderen zellulären Komponenten diskutiert. der bimolekularen Fluoreszenzkomplementierung in Tabak wurde verwendet, um die NRT1.5-Interaktionen an der Plasmamembran zu verifizieren. Es wurden Proteine identifiziert, die mit der pH-Homöostase (AHA2), dem Vesikelverkehr (PEP12 und VAMP722), der Kalzium-regulierten Phosphorylierung (CBL3 und CIPK23) und der Anionen-Homöostase (SLAH1 und SLAH3) in Verbindung stehen. Die Genexpression von AHA2, CBL3, PEP12, SLAH1, SLAH3 und VAMP722 wurde durch die geringe Nährstoffversorgung in der nrt1.5-Mutante beeinträchtigt, was eine molekulare Korrelation zwischen NRT1.5 und den Interaktionspartnern belegt. Die nrt1.5 knockout Mutante zeigte unter K+- und NO3- Mangel verschiedene Phänotypen hinsichtlich Blattseneszenz und Veränderung der Wurzelarchitektur. Die knockout Mutanten cbl3, pep12, slah1, slah3 und vamp722 sowie deren Doppelmutanten mit nrt1.5 zeigten keine Phänotypen, die auf eine biologische Interaktion mit NRT1.5 hinweisen. Das Verständnis der physiologischen Rollen der NRT1.5 Interaktionspartner in der Kalium- und Nitrat-Homöostase war aufgrund der hohen Redundanz aller Kandidaten in ihren Stoffwechselwegen eine Herausforderung. Jedoch war die H+-ATPase AHA2 zusammen mit NRT1.5 in der Lage, die K+-Beladung der Sprossen zu beeinflussen, die Wurzelarchitektur zu modulieren, sowie den extrazellulären pH-Wert und das Plasmamembranpotential zu verändern. Von den 11 Mitgliedern der H+ ATPase wurden AHA4 und AHA6 unter K+ und NO3- Mangel induziert. Das Fehlen von NRT1.5 und AHA2 hatte allerdings einen kritischen Einfluss auf die Genexpression aller 11 Mitglieder, was zu einer Veränderung der Kontrolle des extrazellulären pH-Wertes unter K+ und NO3- Mangel Bedingungen führte. Es wird eine zelluläre Rolle der Interaktion zwischen NRT1.5 und AHA2 vermutet, wobei NRT1.5 durch dessen H+-Antiporterfunktion einen ∆pH im Cytosol erzeugen könnte, den AHA2 an der Plasmamembran der Wurzelzellen wiederherstellen kann. Untersuchungen der Bindungsstellen der NRT1.5-AHA2-Interaktion zeigten, dass ein konservierter Glycinrest in der Transmembrandomäne 5 von NTR1.5, welcher sich mit einem potentiellen LRR-Motiv überschneidet, für die Protein-Protein-Interaktion entscheidend ist. Die Substitution dieses Glycins an Position 209 durch eine geladene Aminosäure beeinträchtigte die K+-Transportfunktion von NRT1.5 und verhinderte die Interaktion mit AHA2. Insgesamt entschlüsselt diese Studie, dass die gemeinsame Aktivität und Funktion von NRT1.5 und AHA2 an der Aufrechterhaltung der Kalium- und Nitrat-Homöostase in Pflanzen beteiligt ist.
