Fluorescence microscopy is an essential tool in biology and medicine. At present, almost any gene of interest (GOI) can be fluorescently labeled within a living cell, enabling research on protein localization, dynamics, and interactions or on biochemical reactions. Furthermore, by using semi-automated or automated fluorescence microscopes, hundreds of images can be acquired with little human intervention. However, the quantification of image-based data obtained through (semi-)automated imaging systems is an elaborate task and requires careful consideration. Therefore, the aim of this PhD thesis was to develop a tool to study the effects of GOIs on neuronal survival after metabolic stress. For this purpose, an overexpression neuronal survival assay was combined with semi-automated fluorescence microscopy and automated image analysis. The development process included modulating the neuronal cell culture protocol, changing the localization of the fluorescent marker protein to enable a transition from a whole-cell fluorescence signal to fluorescent neuronal nuclei, facilitating semi-automated image acquisition using the Leica Matrix screener application, and designing a pipeline for the automatic quantification of neuronal nuclei using the CellProfiler software. Finally, using this assay, neuronal survival quantification can be rapidly performed at different time points while the cells express a detrimental or beneficial GOI. Furthermore, this assay can be easily adapted to various cell types and different stimuli and therefore represents a powerful tool for the broader scientific community. Additionally, as gene overexpression constituted a major component of the neuronal survival assay, different promoters and their performance were tested. As a result, the ubiquitin (UBI) promoter performance was regarded as the most appropriate for the neuronal survival assay. Furthermore, I found evidence for an intrinsic hypoxia inducibility of the cytomegalovirus (CMV) promoter. Destabilized enhanced green fluorescent protein (d2eGFP) expression was decreased around days four through seven in neuronal cultures when d2eGFP was expressed under the control of the CMV promoter, whereas constant d2eGFP expression was detected under UBI promoter control. Remarkably, non-fluorescent cells became bright green fluorescent cells following oxygen-glucose-deprivation (OGD). Likewise, d2eGFP protein levels were readily detectable for all time points when expressed under the control of the UBI promoter, whereas d2eGFP protein levels were measurable only until 24 h after hypoxia when the CMV promoter was employed for d2eGFP overexpression. Consequently, we excluded the CMV promoter as a candidate promoter for the neuronal survival assay because the results indicate that the CMV promoter is hypoxia sensitive and can be reactivated after a short period of hypoxia.
Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine wesentliche Methode im Bereich der biologischen und medizinischen Forschung. Gegenwärtig kann fast jedes Gen von Interesse (GOI) in einer lebenden Zelle fluoreszenzmarkiert werden, welches die Erforschung von Proteinlokalisation, -dynamik und -interaktionen oder sogar von biochemischen Reaktionen ermöglicht. Darüber hinaus lassen sich durch den Einsatz halb- oder vollautomatisierter Fluoreszenzmikroskope Hunderte von Bildern ohne nennenswerte menschliche Intervention aufnehmen. Jedoch stellt die Quantifizierung der durch (halb-)automatisierte Bildgebungssysteme gewonnenen bildbasierten Daten, eine aufwendige und anspruchsvolle Aufgabe dar und erfordert eine eingehendere Betrachtung. Daher ist das Ziel dieser Doktorarbeit, ein Werkzeug zu entwickeln, mit dem die Effekte von Zielgenen auf das Neuronenüberleben nach metabolischem Stress untersucht werden können. Hierzu wurde ein Überexpressions-Neuronen-Assays weiterentwickelt und mit halbautomatisierter Fluoreszenzmikroskopie sowie automatisierter Bildanalyse kombiniert. Der Entwicklungsprozess umfasste Modulationen des neuronalen Zellkulturprotokolls, die Änderung der Lokalisation des Fluoreszenzmarker-Proteins von einem Ganzzell-Fluoreszenzsignal zu fluoreszierenden neuronalen Kernen, die Verwendung von halbautomatisierter Bildaufnahme mithilfe der Leica Matrix Screener-Anwendung sowie den Entwurf einer Pipeline für die automatische Quantifizierung von neuronalen Zellkernen durch die CellProfiler-Software. Letztlich kann durch die Verwendung des Assays, das Neuronenüberleben unter der Expression eines schädlichen oder nützlichen GOI zu verschiedenen Zeitpunkten quantifiziert werden. Darüber hinaus lässt sich dieser Assay leicht an verschiedene Zelltypen und Stress-Stimuli anpassen und stellt daher ein leistungsfähiges Werkzeug für eine breiter gefächerte Wissenschaftsgemeinde dar. Da die Genüberexpression eine Hauptkomponente des neuronalen Überlebenstests darstellt, wurden verschiedene Promotoren bezüglich ihrer Leistung getestet. Infolgedessen wurde die Ubiquitin (UBI) Promotorleistung als die für den neuronalen Überlebensassay am besten geeignete Leistung angesehen. Darüber hinaus fand ich Hinweise auf eine intrinsische Hypoxie-Induzierbarkeit des CMV-Promotors. Die Expression eines destabilisierten, verstärkt grün fluoreszierenden Proteins (d2eGFP) war während der Tage vier bis sieben der neuronalen Kultur verringert, wenn d2eGFP unter der Kontrolle des CMV-Promotors exprimiert wurde, -während eine konstante d2eGFP-Expression unter der Kontrolle des UBI-Promotors nachgewiesen wurde. Interessanterweise wurden aus nichtfluoreszierenden Zellen nach Sauerstoff-Glukose-Entzug, hellgrün fluoreszierende Zellen. Ebenso waren die d2eGFP-Proteinkonzentrationen zu allen Zeitpunkten leicht nachweisbar, wenn sie unter der Kontrolle des UBI-Promotors exprimiert wurden. Die d2eGFP-Proteinkonzentrationen waren dagegen nur bis 24 Stunden nach Hypoxie messbar, als der CMV-Promotor für die d2eGFP-Überexpression eingesetzt wurde. Folglich schlossen wir den CMV-Promotor als Promotor-Kandidat für den neuronalen Überlebens-Assay aus, da die Ergebnisse darauf hinweisen, dass der CMV-Promotor Hypoxie-sensitiv ist und nach einer kurzen Hypoxie-Periode reaktiviert werden kann.
