Hintergrund: Eine Infektion mit dem Humanen Cytomegalovirus (HCMV) kann sich im Rahmen einer Organ- oder Stammzelltransplantation als potentiell lebensbedrohliche Erkrankung manifestieren, weshalb häufig Virostatika zur Prophylaxe und Therapie eingesetzt werden müssen. Entwickelt sich bei protrahierten Verläufen der Verdacht auf eine Virostatika-Resistenz, bedarf es einer genotypischen Resistenztestung, welche resistenzvermittelnde Mutationen detektieren und gegebenenfalls eine Umstellung des Therapieregimes nach sich ziehen kann. Für die zuverlässige Einordnung detektierter Mutationen ist das Vorliegen einer breiten Datenbasis phänotypisch charakterisierter Mutationen und Polymorphismen in resistenzassoziierten Genen erforderlich. Ziel dieser Arbeit war es, zwei bislang unbeschriebene Mutationen im HCMV-UL54-Gen (N855I, F861Y), welche im Kontext einer refraktären HCMV-Infektion eines pädiatrischen Patienten nach allogener Stammzelltransplantation detektiert wurden, zu phänotypisieren und ihre mögliche Auswirkung auf das klinische Erscheinungsbild zu beurteilen.
Methoden: Mittels spurloser Mutagenese wurden die UL54-Mutationen einzeln und in Kombination in ein HCMV-Genom integriert, welches als Bakterielles Artifizielles Chromosom (BAC; Stamm TB40-BAC4) vorlag. Daraus resultierende HCMV-BAC-Mutanten wurden als infektiöses Virus in permissiven Fibroblasten rekonstituiert und hinsichtlich ihrer Replikationskinetik charakterisiert. Für die phänotypische Testung der HCMV-Mutanten bezüglich ihrer Virostatika-Suszeptibilität wurde in dieser Arbeit ein Titer-Reduktions-Assay neu etabliert, welches auf der durchflusszytometrischen Immunotitration basiert. In Triplikaten wurden für jede HCMV-Mutante Ganciclovir- und Foscarnet-Konzentrationen bestimmt, welche den Virustiter um 50% reduzieren (EC50). Anhand der EC50-Ratio (EC50 Mutante ÷ EC50 Wildtyp) wurde das Verhältnis zum sensitiven HCMV-Wildtyp und mitgeführten Referenzmutanten ermittelt und die Virostatika-Suszeptibilität eingestuft. Ferner erfolgte eine Gegenüberstellung der Ergebnisse des neu etablierten Titer-Reduktions-Assays mit denen eines konventionellen Plaque-Reduktions-Assays.
Ergebnisse: Für die HCMV-UL54-Mutanten N855I, F861Y und N855I/F861Y zeigte sich eine leichte Verzögerung und Verminderung der viralen Replikation. Hinsichtlich der Virostatika-Suszeptibilität wurden mit dem Titer-Reduktions-Assay konsistent niedrigere EC50-Werte und EC50-Ratios als mit dem Plaque-Reduktions-Assays ermittelt. Die Mutationen UL54 N855I, UL54-F861Y und UL54-N855I/F861Y zeigten sich demnach im Titer-Reduktions-Assay als Ganciclovir-und Foscarnet sensitiv. Mit dem Plaque-Reduktions-Assay konnte UL54 N855I ebenfalls als Ganciclovir-und Foscarnet-sensitiv charakterisiert werden, während EC50-Ratios für die UL54-Doppelmutante N855I/F861Y eine geringfügige Foscarnet-Resistenz und für UL54-F861Y eine geringgradige Ganciclovir- und Foscarnet-Resistenz anzeigten.
Schlussfolgerungen: Es konnte gezeigt werden, dass die UL54-Mutationen N855I und F861Y einzeln und in Kombination eine geringe Einschränkung der Virusreplikation vermitteln. Eine hochgradige Ganciclovir- und Foscarnet-Resistenzvermittlung kann für die Mutationen mit den Ergebnissen dieser Arbeit ausgeschlossen werden. Eine eindeutige quantitative Einstufung der assoziierten Virostatika-Suszeptibilität und die Bedeutung weiterer retrospektiv detektierter Mutationen für die Entwicklung der klinischen Therapierefraktärität sollte durch weitere phänotypische Testungen eruiert werden. Der neu etablierte Titer-Reduktions-Assay erzielt reproduzierbare und objektive Ergebnisse und kann daher perspektivisch eine alternative Methode für phänotypische Resistenztestungen darstellen.
Background: Human cytomegalovirus (HCMV) infection can manifest as a potentially life-threatening disease after organ or stem cell transplantation, which is why antiviral prophylaxis and treatment are often mandatory. If antiviral resistance is suspected, genotypic resistance testing is required to detect resistance-associated mutations in order to adapt the therapy regimen accordingly. Reliable classification of detected mutations requires a broad database of phenotypically characterized mutations and polymorphisms in resistance-associated genes. The aim of this work was to describe previously unknown HCMV-UL54-mutations N855I and F861Y that were detected in the context of a refractory HCMV infection in a pediatric patient after allogeneic stem cell transplantation and to assess their potential impact on the clinical presentation.
Methods: Using markerless mutagenesis, UL54 mutations were introduced individually and in combination into a bacterial artificial chromosome (BAC; strain TB40-BAC4) harboring the HCMV genome. Resulting HCMV BAC mutants were reconstituted as infectious virus in fibroblasts and examined for viral growth kinetics. Using flow cytometric immunotitration, a titer reduction assay was established to assess antiviral drug susceptibility. For each HCMV mutant Ganciclovir and Foscarnet concentrations required to reduce viral titer by 50% (EC50) were determined. Using the EC50 ratio (EC50 mutant ÷ EC50 parental virus), the relation between undescribed mutations, sensitive HCMV-wildtype and well-known reference mutants was described and antiviral drug susceptibility was classified. Furthermore, results of the titer reduction assay were compared to those of a conventional plaque reduction assay.
Results: UL54-mutations N855I, F861Y and N855I/F861Y slightly delayed and restricted viral growth. Consistently, the TRA yielded lower EC50 values and EC50 ratios than the plaque reduction assay. Based on the titer reduction assay, the mutations were found to be sensitive to Ganciclovir and Foscarnet. EC50 ratios resulting from plaque reduction assay indicated low-grade foscarnet resistance for the UL54 double mutant N855I/F861Y and low-grade ganciclovir and foscarnet resistance for UL54-F861Y. UL54-N855I was characterized as ganciclovir- and foscarnet-sensitive.
Conclusion: The UL54-mutations N855I and F861Y individually and in combination confer a slight viral growth restriction, but high-grade ganciclovir and foscarnet resistance can be excluded. A precise quantitative classification of conferred antiviral drug susceptibility and the significance of later detected mutations for the development of refractory HCMV infection should be elucidated by further phenotypic testing. The established titer reduction assay provides reproducible and objective results, making it a possible prospective alternative method for phenotypic resistance testing.
