Aus tierschutzrechtlichen und ethischen Gründen werden seit einigen Jahren vermehrt Alternativen zu den regulatorisch verbindlichen Tierversuchen entwickelt. Einer der standardmäßig zu testenden Endpunkte in der Chemikalienzulassung ist die Sensibilisierung durch Hautkontakt. Für diesen Endpunkt existieren bereits mehrere Alternativmethoden, doch bisher deckt keine das in vivo entscheidende Schlüsselereignis der Sensibilisierungsphase – die Aktivierung von T-Zellen – ab. Das hängt mit der im Experiment limitierten Stimulierbarkeit von T-Zellen durch aktivierte dendritische Zellen zusammen; bei der Verwendung von primären T-Zellen kommt eine hohe Spendervariabilität hinzu. Beide Faktoren beeinflussen die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse stark und insbesondere schwache Hautsensibilisierer werden von den Systemen nicht zuverlässig erkannt. Eine mögliche Ursache für die eingeschränkte Stimulierbarkeit könnte die immunologische Gegenregulation der Aktivierung über immunsupprimierende Rezeptoren sein. Zielstellung der Arbeit war es daher, ein In-vitro-Testsystem zu entwickeln, das auf Grundlage von Zelllinien auch den letzten, T-Zell-vermittelten, Schritt der Sensibilisierungsphase abdeckt. Dazu sollten die immunsuppressiven Rezeptoren Arylhydrocarbon-Rezeptor (AhR) und PD-L1 in dendritischen/monozytären Zellen gentechnisch oder mittels Antikörper ausgeschaltet bzw. blockiert werden, um die nachfolgende Aktivierung von T-Zellen im System zu verstärken. Das entwickelte Testsystem basierte auf dem in der Arbeitsgruppe etablierten loose-fit coculture-based sensitization assay with lymphocyte endpoint (LCSA-ly), in dem jedoch mit primären Zellen gearbeitet worden war. Die Experimente wurden zunächst parallel mit zwei monozytären Zelllinien (MUTZ-3 und THP-1) durchgeführt, wobei MUTZ-3 zu Langerhans-Zellen (MUTZ-LC) differenziert wurden. In beiden Zelltypen wurde der PD-L1 mit einem monoklonalen Antikörper blockiert und der AhR mittels CRISPR/Cas9 ausgeknockt. Zur Reduktion des Prozentsatzes AhR-positiver Zellen in den Knockout-Populationen wurde ein Selektionsprotokoll für AhR-negative Zellen entwickelt. Dazu wurden die Populationen zunächst mit Dibutylphthalat behandelt, welches AhR-vermittelt Apoptose auslöst. Danach wurden die apoptotischen Zellen mit Hilfe magnetischer Annexin V-Beads aus der Kultur entfernt. Da sich die monozytäre Zelllinie THP-1 als suszeptibler für die vorgenommenen Modifikationen erwies, wurden Zellen dieser Linie im Testsystem eingesetzt. Das Testsystem wurde als Stufensystem entwickelt, bei dem in Stufe 1 unterschiedlich modifizierte THP-1 mit HaCaT-Keratinozyten kokultiviert und mit Testsubstanzen (Dinitrochlorbenzol [DNCB] als extremes Allergen, Mercaptobenzothiazol [MBT] als moderates Allergen und Natriumlaurylsulfat [SLS] als nicht allergene Substanz) behandelt wurden. Daran angeschlossen erfolgte in Stufe 2 eine Kokultur der Testsubstanz-stimulierten THP-1 mit Zellen der T-Zelllinie Jurkat. Die Aktivierung der beteiligten Zelltypen wurde durchflusszytometrisch über die Messung der Expression des Reifungsmarkers CD86 und des Adhäsionsmoleküls CD54 auf THP-1 sowie der Proliferationsaktivität (über den Mitosemarker Ki-67) und der Expression des T-Zell-Rezeptor-Korezeptors CD3 auf Jurkat ermittelt. Außerdem wurde die Sekretion von Zytokinen in das Medium der Kokulturen mit Sandwich-ELISA und Multiplex-Assay untersucht. Zur Verdeutlichung des Gesamtergebnisses aus dem neuen Testsystem wurde eine Heatmap angelegt, in die die Veränderungen der gemessenen Parameter bezogen auf unbehandelte Kontrollen anhand eines Farbcodes eingetragen wurden (rot: Reduktion eines Parameters im Vergleich zur Kontrolle, grün: Erhöhung eines Parameters im Vergleich zur Kontrolle). Aus der Differenzierungskultur von MUTZ-3 gingen Zellen eines Phänotyps mit Charakteristika von Langerhans-Zellen und dermalen dendritischen Zellen des Typs 2 hervor. Diese regulierten nach Stimulation mit DNCB und MBT in Kokultur mit HaCaT CD86 konzentrationsabhängig hoch. Die Blockade von PD-L1 mit einem spezifischen Antikörper war erfolgreich und reduzierte den Prozentsatz PD-L1-positiver Zellen statistisch signifikant. Die Blockade führte auch ohne Testsubstanz-Behandlung zu einer Hochregulation von CD86 und CD54. Der CRISPR/Cas9-vermittelte AhR-Knockout reduzierte den Prozentsatz AhR-positiver Zellen in der MUTZ-3-Population um rund 10 %. In THP-1 wurde mit dem Knockout-Protokoll eine Reduktion der AhR-positiven Zellen um 15 % erreicht. Das Selektionsprotokoll reduzierte den Anteil auf im Median 33 %, lieferte also eine ganz überwiegend AhR-negative Population. Auch der Prozentsatz PD-L1-positiver Zellen konnte in Populationen von THP-1 und geneditierten THP-1 mittels Antikörperblockade statistisch signifikant gesenkt werden. Die Behandlung der unterschiedlich modifizierten THP-1 (mit und ohne PD-L1-Blockade, mit und ohne AhR-Knockout) mit den Allergenen DNCB und MBT Aus der Differenzierungskultur von MUTZ-3 gingen Zellen eines Phänotyps mit Charakteristika von Langerhans-Zellen und dermalen dendritischen Zellen des Typs 2 hervor. Diese regulierten nach Stimulation mit DNCB und MBT in Kokultur mit HaCaT CD86 konzentrationsabhängig hoch. Die Blockade von PD-L1 mit einem spezifischen Antikörper war erfolgreich und reduzierte den Prozentsatz PD-L1-positiver Zellen statistisch signifikant. Die Blockade führte auch ohne Testsubstanz-Behandlung zu einer Hochregulation von CD86 und CD54. Der CRISPR/Cas9-vermittelte AhR-Knockout reduzierte den Prozentsatz AhR-positiver Zellen in der MUTZ-3-Population um rund 10 %. In THP-1 wurde mit dem Knockout-Protokoll eine Reduktion der AhR-positiven Zellen um 15 % erreicht. Das Selektionsprotokoll reduzierte den Anteil auf im Median 33 %, lieferte also eine ganz überwiegend AhR-negative Population. Auch der Prozentsatz PD-L1-positiver Zellen konnte in Populationen von THP-1 und geneditierten THP-1 mittels Antikörperblockade statistisch signifikant gesenkt werden. Die Behandlung der unterschiedlich modifizierten THP-1 (mit und ohne PD-L1-Blockade, mit und ohne AhR-Knockout) mit den Allergenen DNCB und MBT induzierte konsistent eine Erhöhung der Expression gemessenen Marker bezogen auf die Expressionen auf unbehandelten, nicht modifizierten THP-1. Dabei wurde die CD54-Expression nach DNCB-Behandlung auf AhR-Knockout Zellen im Vergleich zu nicht geneditierten Zellen stärker erhöht. Die Behandlung mit dem Irritanz SLS führte in nicht geneditierten Zellen zu einer leichten, nicht signifikanten Erhöhung der CD86-Expression und zu keiner Veränderung der Expression von CD54. Auf geneditierten Zellen wurden die Expressionen beider Marker nach Behandlung mit SLS reduziert, für CD54 war dies statistisch signifikant. Damit ergab sich mit dem Einsatz geneditierter Zellen eine Möglichkeit, das Irritanz deutlicher von den Allergenen zu unterscheiden als mit nicht geneditierten Zellen. In der nachgeschalteten Kokultur Testsubstanz-aktivierter THP-1 verschiedener Modifikationen mit Jurkat-T-Zellen zeigten sich ebenfalls ausgeprägte Effekte der PD-L1-Blockade und/oder des AhR-Knockouts. Insbesondere in den Kokulturen mit AhR-defizienten und/oder PD-L1-blockierten THP-1 konnten nach vorangegangener Behandlung mit Allergenen signifikante Expressionsveränderungen von CD3 auf Jurkat sowie eine Regulation der Proliferation der T-Zellen gemessen werden, nach Behandlung mit dem Irritanz jedoch nicht. Auch für die Konzentrationen der vier in den Überständen der Jurkat-Kokultur nachgewiesenen Zytokine MIP-1b, MIP-3a, TNF-a und IL-8 wurden in Kokulturen mit Allergen-behandelten, modifizierten THP-1 verglichen mit Kokulturen unbehandelter THP-1 markantere Unterschiede gemessen als in Kokulturen mit unmodifizierten THP-1. So führte die PD-L1-Blockade konsistent zu einer Hemmung der Zytokin-Produktion bezogen auf Kokulturen mit unbehandelten Kontrollen, wenn die monozytären Zellen mit Allergenen behandelt worden waren. In Kokulturen mit AhR-defizienten THP-1 wurden die Zytokinkonzentrationen hingegen nach Allergen-Behandlung der monozytären Zellen meistenteils gegenüber Kokulturen mit unbehandelten Kontrollen erhöht. In der Gesamtauswertung mit Hilfe der Heatmap zeigte sich, dass der Einsatz AhR-defizienter und/oder PD-L1-blockierter THP-1 im Testsystem zu einer Verschiebung des Farbschemas abhängig von der allergenen Potenz der eingesetzten Testsubtanz führte. Dabei induzierte die alleinige PD-L1-Blockade eine Verschiebung in Richtung Rot (Hemmung der gemessenen Parameter) und die gleichzeitige Blockade mit AhR-Knockout eine Verschiebung in Richtung Grün (Induktion der gemessenen Parameter). Dies war vor dem Einsatz modifizierter THP-1 nicht der Fall. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass sich die myelomonozytäre Zelllinie MUTZ-3 im optimierten Differenzierungsprotokoll zu Langerhans-ähnlichen Zellen differenzieren ließ, die auf den Stimulus mit Allergenen mit der Regulation von CD86 reagierten. Der entstehende Phänotyp ließ sich über die Differenzierungsdauer modulieren, so dass sich differenzierte MUTZ-3 als Alternative für primäre Monozyten-abgeleitete dendritische Zellen in der Grundlagenforschung eignen. Die Blockade des PD-L1 erbrachte zudem Anzeichen für ein sog. reverse signalling über diesen Rezeptor. Zusammen mit der gezeigten Regulation von PD-L1 durch Behandlung von MUTZ-LC mit starken Allergenen kann das für die Untersuchung der Funktionen dieses Rezeptors von Interesse sein. Vermutlich aufgrund ihres hohen Anspruchs an die Kulturbedingungen waren MUTZ-3 jedoch weniger suszeptibel für den AhR-Knockout mittels CRISPR/Cas9 als THP-1. Die monozytäre Zelllinie THP-1 erwies sich als sinnvolle Alternative zu differenzierten MUTZ-3. Zum einen war der AhR-Knockout in diesen Zellen erfolgreicher und zum anderen wird PD-L1 auf THP-1 zu einem geringeren Anteil exprimiert, so dass die Blockade des Rezeptors unter Verwendung eines spezifischen monoklonalen Antikörpers eine zu 95 % PD-L1-negative Population hervorbrachte. Beim Einsatz der AhR-Knockout-Zellen im entwickelten Testsystem wurde deutlich, dass der AhR an der Regulation der Expression von CD86, CD54 und PD-L1 beteiligt ist. Gleichzeitig konnte auch ein Einfluss der PD-L1-Blockade auf die AhR-Expression gezeigt werden, was interessante Perspektiven auf eine mögliche Koregulation der beiden Rezeptoren in THP-1 eröffnet. In der Kokultur mit HaCaT wurde die Aktivierung von AhR-Knockout-Populationen durch die Behandlung mit Testsubstanzen stärker moduliert als die nicht geneditierter Zellen. In den Jurkat-Kokulturen zeigte sich, dass die PD-L1-Blockade allein und in Kombination mit dem AhR-Knockout die Stimulierbarkeit von Jurkat durch Allergen-aktivierte THP-1 erhöht. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass der AhR-Knockout und die PD-L1 Blockade in THP-1 die nachfolgende Stimulation von T-Zellen in vitro verstärkten und zu einer erhöhten Sensitivität des entwickelten Testsystems in Bezug auf die Schlüsselereignisse „Aktivierung von dendritischen Zellen“ und „Aktivierung von T-Zellen“ führten. Auf diese Weise wurde ein praktikables In-vitro-System molekularbiologisch weiterentwickelt, was eine Verfeinerung gegenüber den etablierten Testmethoden darstellt. Das System ist nach Validierung für den regulatorischen Einsatz in EU-Zulassungsverfahren von Chemikalien und Arzneimitteln qualifiziert. Somit konnten alle Ziele der Dissertation experimentell adressiert und erfüllt werden.
Due to ethical and animal welfare considerations, more and more alternative methods are recently being developed to replace mandatory animal testing in regulatory context. One of the standard endpoints to be tested in chemical registration is skin sensitisation. There are several OECD-validated alternative methods for this endpoint. However, none of these covers the last crucial key event of the sensitisation phase in vivo – the activation of T cells. This is due to the poor stimulation of T cells by activated dendritic cells in vitro. A high donor variability when using primary human cells adds to the problem, leading to major reproducibility issues. Thus, weak sensitisers in particular are seldomly recognized by the respective test systems. One possible cause for the limited stimulation of T cells is the counter regulation by immunosuppressive receptors. Therefore, the aim of this thesis was to develop an in vitro assay based on cell lines that also covers the last, T cell-mediated, key event of the sensitisation phase. To achieve this aim, the immunosuppressive receptors aryl hydrocarbon receptor (AhR) and programmed cell death ligand1 (PD-L1) in dendritic or monocytic cells were to be knocked out genetically or blocked using antibodies to facilitate the following activation of T cells in the test system. The developed test system was based on the coculture-based sensitisation assay with lymphocyte endpoint (LCSA-ly) established in the working group. However, the LCSA-ly used primary human cells. Experiments were conducted with two the monocytic cell lines MUTZ-3 and THP-1, and MUTZ-3 were differentiated to Langerhans cell resembling cells. In both cell types, PD-L1 was blocked using a monoclonal antibody, and AhR was knocked out by CRISPR/Cas9. To further reduce the percentage of AhR-positive cells in knockout populations a selection protocol was developed. It made use of dibutyl phthalate which causes apoptosis in AhR-positive cells. Apoptotic cells were removed from the culture with Annexin V magnetic microbeads. Cells of the monocytic cell line THP-1 were more susceptible to these modifications than MUTZ-3. Therefore, THP-1 were used in the newly developed assay system. A two tiers system was established. In the first tier, differently modified THP-1 were cocultured with HaCaT keratinocytes and treated with test substances (dinitrochlorobenzene [DNCB] as an extreme sensitiser, mercaptobenzothiazole [MBT] as a moderate sensitiser, and sodium lauryl sulfate [SLS] as a non-sensitiser). In tier 2, test substance stimulated THP-1 were cocultured with Jurkat T cells. Activation of the involved cell types was determined by flow cytometric measurement of surface antigen expression. The expression of CD86 as maturation marker, and CD54 as adhesion molecule was assessed on THP-1. For Jurkat cells, the T cell receptor coreceptor CD3 expression and proliferation (via mitosis maker Ki-67) were measured. Moreover, cytokine secretion into the culture media was determined by sandwich ELISA and multiplex assay. The overall result of these measurements was aggregated in a heatmap showing the alteration of all parameters relative to controls in a colour code (red: reduction of a particular parameter, green: increase of a particular parameter). Differentiation culture of MUTZ-3 produced cells of a mixed phenotype with characteristics of Langerhans cells and type 2 dermal dendritic cells. These upregulated CD86 in coculture with HaCaT upon treatment with DNCB and MBT. Blockade of PD-L1 with a specific antibody was successful and significantly reduced the percentage of PD-L1-positive cells. Even without a test substance treatment, blockade of PD-L1 led to an upregulation of CD86 and CD54. Knockout of AhR using CRISPR/Cas9 technique decreased the number of AhR-positive MUTZ-3 by approximately 10 %. In THP-1, knockout decreased the percentage of AhR-positive cells in the population by 15 %. The selection protocol further reduced the proportion of AhR-positive THP-1 to a median of 33 %, yielding a predominantly AhR-negative population. After incubation with the monoclonal blocking antibody, the percentage of PD-L1-positive cells was also statistically significantly reduced in THP-1 and genetically edited THP-1 populations. Treatment of the various THP-1 modifications (with and without AhR-knockout, with and without PD-L1 blockade) with DNCB and MBT led to consistent upregulation of both examined markers (CD86, CD54). On genetically edited cells, upregulation of CD54 expression after DNCB treatment was more pronounced than on wildtype cells. Treatment with the irritative substance SLS led to a slight, statistically not significant upregulation of CD86 on wildtype cells. Expression of CD54 was not altered by SLS treatment on these cells. On genetically edited cells, expression of both markers was reduced after SLS treatment, this was statistically significant for CD54. Thus, the use of modified THP-1 helped to discriminate more clearly between sensitisers and non-sensitisers. In the subsequent coculture of test substance-activated THP-1 modifications with Jurkat T cells marked effects of AhR knockout and PD-L1 blockade were observed. In cocultures with AhR knockout cells or cells with blocked PD-L1 treated with allergens, there were significant changes in the CD3 expression and the proliferation of Jurkat compared to untreated or SLS treated controls. Allergen treatment also induced changes in cytokine concentrations (MIP-1b, MIP-3a, TNF-a, and IL-8) in Jurkat culture supernatants as compared to untreated control cocultures when THP-1 were modified by AhR knockout or PD-L1 blockade. Thus, in cocultures with PD-L1 blocked THP-1, cytokine production was consistently inhibited after allergen treatment as compared to untreated controls. Allergen treatment of AhR knockout cells mostly induced cytokine production in Jurkat cocultures compared to untreated controls. The overall assessment of results using a heatmap showed a colour shift depending on sensitisation potency of the test substance. With PD-L1 blocked THP-1, the colours shifted to red, revealing an inhibition of measured parameters. Whereas additional AhR knockout led to a colour shift to green, signalling an induction of the measured parameters. This colour shift was not observed using unmodified THP-1 in the test system. Results show that in an optimised protocol myelomonocytic MUTZ-3 cells were differentiated to a Langerhans cell-related cell type (MUTZ-LC) that upregulated CD86 upon stimulation with allergens. The emerging phenotype could be modulated by differentiation culture duration. This makes differentiated MUTZ-3 a viable alternative to primary monocyte-derived dendritic cells in basic research. Upregulation of CD86 und CD54 on these cells after blockade of PD-L1 suggested reverse signalling via this receptor. Together with the demonstrated regulation of PD-L1 upon allergen treatment, this offers a means to study biological functions of this receptor. However, possibly due to their need for special culture conditions MUTZ-3 were less susceptible to AhR knockout by CRISPR/Cas9 than THP-1. The monocytic cell line THP-1 proved to be a useful alternative to MUTZ-LC. Knockout of AhR was more successful in these cells, and PD-L1 was expressed to a lesser extent facilitating blocking by a specific monoclonal antibody which led to a 95 % PD-L1-negative population. When using AhR knockout cells in the newly established test system, it became clear that AhR is involved in the regulation of CD86, CD54, and PD-L1 expression. At the same time, PD-L1 blockade had an influence on the AhR expression, which opens interesting perspectives to a possible co-regulation of both receptors in THP-1. In the coculture with HaCaT AhR-knockout THP-1 showed increased activation by sensitisers as against wildtype cells. In coculture with Jurkat, PD-L1 blockade alone and in combination with AhR knockout led to an enhanced stimulability of the T cells. In summary, PD-L1 blockade and AhR knockout in THP-1 boosted stimulation of T cells in vitro and enhanced sensitivity regarding key events “activation of dendritic cells” and “activation of T cells”. In this manner, a feasible in vitro test system was refined as compared to well-established methods using molecular biological techniques. After validation, the newly developed test system will be qualified for regulatory use in the scope of EU registration processes for chemicals and drugs. Thus, all defined aims of this thesis were addressed experimentally, and all objectives were attained.
