Background and aims: The importance of nucleic acid-based methods (“gene therapy”) for innovative concepts for the treatment of heart failure is growing steadily, but their clinical translation is only progressing slowly. A fundamental problem in the preclinical assessment of the transduction/ transfection efficiency is that human cardiomyocytes are only present in suspension or culture, while in vivo disease models are necessarily based on other species. In the present work, an organotypic heart slice culture model was established in order to directly examine the transduction efficiency of cells in the intact myocardium by different serotypes of adeno-associated viruses (AAVs). Methods: Left ventricular tissue derived from 16±1-day-old homozygous alpha-myosin heavy-chain-mCherry mice was cut into 100–300 µm-thick slices by a vibrating microtome. The heart slices were cultured in an air-liquid interface culture system and their viability was assessed by calcein-acetoxymethyl ester staining, mCherry fluorescence intensity, and the tetrazolium assay. The cardiomyocytes were identified by immunofluorescence staining of cardiac Troponin T (cTNT). AAV vectors (AAV 1, 2, 6, 8) for constitutive expression of a GFP reporter gene were applied to the surface of the slices. The transduction efficiency, the number of GFP-positive cells, and the GFP-positive subpopulations were determined after 5 days. Results: The mCherry fluorescence signal was specifically detected in cTNT-positive cells and thus indicates cardiomyocytes. Under normoxic culture, heart slices could maintain good viability for at least 5 days based on the mCherry fluorescence intensity and the calcein fluorescence area. Among the four serotypes, AAV6-mediated GFP expression resulted in the highest GFP-positive cell number in slices. AAV1- and 8-infected slices presented fewer GFP-positive cells, with almost no GFP signal was detected in AAV2-infected slices. AAV6 showed the best myocardial penetration. Almost 100% of the cardiomyocytes appeared GFP-positive, whereas the proportion of GFP-positive cardiac fibroblasts was only approximately 12%. None of the AAV serotypes induced any relevant cytotoxicity. Conclusions: AAV-mediated gene transfer in cardiac cells can be induced and quantified in an organotypic murine heart slice culture system. AAV6 shows the highest in situ transduction efficiency. In the future, this model can be applied to pathologically altered human myocardium.
Hintergrund und Ziele: Die Bedeutung Nukleinsäure-basierter Verfahren („Gentherapie“) für innovative Konzepte zur Behandlung der Herzinsuffizienz wächst stetig, ihre klinische Translation schreitet jedoch nur langsam voran. Ein grundsätzliches Problem bei der präklinischen Beurteilung der Transduktions-/Transfektionseffizienz ist, dass humane Kardiomyozyten lediglich in Suspension bzw. Kultur vorliegen, während In-vivo-Krankheitsmodelle notwendigerweise auf anderen Spezies basieren. In der vorliegenden Arbeit wurde daher ein organotypisches Herzschnitt-Kulturmodell etabliert, um die Effizienz der Transduktion von Zellen im intaktem Myokard durch unterschiedliche Serotypen von Adeno-assoziierten Viren (AAV) direkt zu untersuchen. Methoden: Linksventrikuläres Gewebe von 16±1 Tage alten homozygoten Alpha-Myosin-Heavy-Chain-mCherry-Mäusen wurde mit einem Vibrationsmikrotom in 100–300 μm dicke Scheiben geschnitten. Die Gewebescheiben wurden in einem Luft-Flüssigkeit-Grenzflächenkultursystem kultiviert, ihre Vitalität durch Calcein-Acetoxymethylester-Färbung, mCherry-Fluoreszenzintensität und Tetrazolium-Assay verfolgt und Kardiomyozyten durch Immunfluoreszenzfärbung von Troponin T (cTNT) identifiziert. AAV-Vektoren (AAV 1, 2, 6, 8) für die konstitutive Expression eines GFP-Reportergens wurden auf die Oberfläche des Gewebes appliziert. Die Transduktionseffizienz, die Anzahl GFP-positiver Zellen sowie die GFP-positiven Subpopulationen wurden nach 5 Tagen bestimmt. Ergebnisse: Das mCherry-Fluoreszenzsignal wurde spezifisch in cTNT-positiven Zellen detektiert und zeigt somit Kardiomyozyten an. In Normoxie konnte die Vitalität des Gewebes basierend auf der mCherry-Fluoreszenzintensität und der Calcein-Fluoreszenzfläche für mindestens 5 Tage aufrechterhalten werden. Unter den vier Serotypen führte die AAV6-vermittelte GFP-Expression zu der höchsten GFP-positiven Zellzahl in Schnitten. AAV1- und 8-infizierte Schnitte zeigten weniger GFP-positive Zellen, in AAV2-infizierten Schnitten wurde fast kein GFP-Signal detektiert. AAV6 zeigte die beste Durchdringung des Myokards. Fast 100% der Kardiomyozyten erschienen GFP-positiv, während der Anteil GFP-positiver kardialer Fibroblasten lediglich ca. 12% betrug. Keiner der AAV-Serotypen induzierte eine relevante Zytotoxizität. Schlussfolgerungen: AAV-vermittelter Gentransfer in Herzmuskelzellen kann in einem organotypischen murinen Gewebekultursystem induziert und quantifiziert werden. AAV6 zeigt die höchste In-situ-Transduktioneffizienz. In Zukunft soll dieses Modell auf pathologisch verändertes humanes Myokard übertragen werden.
