Background: Cardiac remodeling plays an important role in cardiac disease such as volume overload (mitral regurgitation), pressure overload (aortic stenosis, hypertension), inflammation (myocarditis), genetical disorders (DCM) or ischemia (myocardial infarction). The characterization of signaling pathways in cardiac remodeling is still under investigation. MMPs are endoproteases that influence ECM turnover and their role has been implicated in remodeling. MMP-13 is a metalloprotease expressed at very low levels in the healthy myocardium, but it is up-regulated in the remodeling process. FOXO3a is a transcription factor that plays an important role in diverse basic biological mechanisms such as detoxification of toxic oxygen derived radicals, glucose metabolism, DNA-repair, apoptosis and adaptive cardiac myocyte size. However, its role in cardiac matrix remodeling has not as yet been studied . Methods: Neonatal rat cardiac fibroblasts (NRFB) and cardiomyocytes (NRVM) were transduced in vitro with a replication defective adenoviral vector (AdV5-CMV-GFP) or an adenoviral vector that encodes a constitutively active FOXO3a (AdV5-CMV-TM-FOXO3a) or wild-type FOXO3a (WT-FOXO3a). mRNA expression of various ECM regulators was quantified by qRT-PCR. Protein expression and signal transduction pathways were characterized using western blotting. DNA-binding assays were used to better understand the mechanistic effect of FOXO3a. On a functional level, the collagenolytic activity was determined. The results were also confirmed in vivo using FOXO3a deficient mouse fibroblasts. Effects of FOXO3a were determined in a murine MI and viral myocarditis model. Results: Transduction of NRVM with WT-FOXO3a or TM-FOXO3a did not change expression levels of MMP-1, -3, -9 or TIMP-1, -2 or -4. However, TM-FOXO3a gene transfer dose-dependently up-regulated MMP-13 mRNA and protein expression. Furthermore, endogenous FOXO3a led to higher levels of MMP-13 mRNA in both cell types. An increased collagenolytic activity was detected in NRFB after FOXO3a overexpression by collagenase assay. Mechanistically, FOXO3a directly binds and trans-activates the MMP-13 promoter in NRVM. The up-regulation of MMP-13 could also be confirmed in in vivo models of cardiac injury i.e. MI in FOXO3a wildtype and knockout mice. Moreover, FOXO3a-/- showed an up-regulation of MMP-13 mRNA levels in the CVB3 murine myocarditis model. 10 Conclusions: Transduction of NRVM with WT-FOXO3a or TM-FOXO3a did not influence the expression of MMP-1, -3, -9 or TIMP-1, -2 or -4. Through up-regulation of MMP-13 expression, FOXO3a leads to collagen degradation. The transcription factor plays an important role in the coordination of cell size and cardiac matrix remodeling. Further studies of the effect of FOXO3a on cell-matrix interaction in cardiac injury models would define a potential clinical use of this interaction.
Hintergrund: Das kardiale Remodeling spielt bei vielen kardialen Erkrankungen, wie beispielsweise einer Volumenüberlastung (Mitralinsuffizienz), einer Drucküberlastung (Aortenstenose, Hypertonie), einer Entzündung (Myokarditis), genetischen Erkrankungen (DKM) oder einer Ischämie (Myokardinfarkt) eine bedeutende Rolle. Die Charakterisierung von Signaltransduktionswegen im kardialen Remodeling wird derzeitig aktiv untersucht. MMPs sind Endoproteinasen, die den Umsatz der extrazellulären Matrix (EZM) beeinflussen, und ihre Rolle wurde mit dem Remodeling in Verbindung gebracht. MMP-13 ist eine Kollagenase, die im gesunden Myokard in sehr niedrigen Konzentrationen exprimiert wird, aber im Remodeling-Prozess hochreguliert ist. FOXO3a ist ein Transkriptionsfaktor, der eine wichtige Rolle bei verschiedenen grundlegenden biologischen Prozessen wie der Entgiftung von toxischen Sauerstoffradikalen, dem Glukosestoffwechsel, der DNA-Reparatur, dem Zelltod und der adaptiven Zellgrösse von kardialen Myozyten spielt. Seine Rolle beim kardialen Remodeling der extrazellulären Matrix wurde bisher noch nicht untersucht. Methodik: Neonatale kardiale Rattenfibroblasten (NRFB) und Kardiomyozyten (NRVM) wurden in vitro mit einem replikationsdefekten adenoviralen Kontrollvektor (AdV5-CMV-GFP) oder einem adenoviralen Vektor, der konstitutiv aktives FOXO3a (ADV5-CMV-TM-FOXO3a) oder WT-FOXO3a kodiert, transduziert. Die mRNA Expression verschiedener EZM- Regulatoren wurde mittels qRT-PCR quantifiziert. Die Proteinexpression sowie die Siagnaltransduktion wurde mittels Western blotting charakterisiert. DNA- Bindungsassays und Promoteranalysen dienten der Aufklärung der mechanistischen Effekte von FOXO3a. Funktionell wurde die Kollagenase-Aktivität bestimmt. Diese Ergebnisse wurden auch mit Hilfe von FOXO3a defizienten Mausfibroblasten best tigt. Die in vivo Effekte von FOXO3a wurden in einem murinen Infarktmodell sowie Myokarditismodell determiniert. Ergebnisse: Die Transduktion der NRVM mit WT-FOXO3a oder TM-FOXO3a zeigte keine Hochregulation von MMP-1, -3, -9, TIMP-1, -2 und -4. Die berexpression von FOXO3a in NRFB und NRVM resultierten in einer dosisabhängigen Erhöhung der MMP-13 mRNA. Darüber hinaus führte endogenes FOXO3a zu einer höheren Expression von MMP-13 mRNA in beiden Zelltypen. Durch das Kollagenase-Assay wurde auch eine erhöhte kollagenolytische Aktivität in NRFB nach FOXO3a berexpression nachgewiesen. In dem Infarktmodell führte die Aktivierung von FOXO3a zu einer Hochregulation von MMP-13. FOXO3a-/- M use zeigten eine Hochregulation von MMP-13 in einem viralen Myokarditismodell. Schlussfolgerung: FOXO3a führt über die Hochregulation der MMP-13 Expression zum Kollagen-Abbau. Der Transkriptionsfaktor spielt eine bedeutende Rolle in der Koordination von Zellgrösse und Remodeling der extrazellulären Matrix. Weitere Studien der FOXO3a Effekte auf die Zell-Matrix-Interaktion in kardialen Schädigungsmodellen können einen eventuellen klinischen Nutzen dieser Interaktion definieren.
