The androgen receptor (AR) and glucocorticoid receptor (GR) are closely related transcription factors that have distinct biological functions but recognize nearly identical DNA binding sites. To provide insights into this apparent paradox, I studied the role of genomic binding, the chromatin environment and cofactor interactions in driving receptor-specific gene regulation. To study differences of the receptors in an identical cellular context I generated a U2OS cell line stably expressing AR and compared it to the existing GR-expressing U2OS cell line. Activation of the receptors revealed the expression of receptor-specific as well as shared target genes. I found that receptor-specific gene expression can in part be driven by subtle binding differences of the receptors. In order to investigate whether divergent DNA binding can be a consequence of different abilities to bind to inaccessible chromatin I performed ATAC-seq in both cell lines. The analysis revealed a receptor-specific ability of GR to bind to closed chromatin which in turn directs GR-specific binding and gene regulation. Furthermore, to understand the effect of the sequence composition on differential binding, I compared the genomic loci that are selectively occupied by one of the receptors. Notably, GR showed a preference for GC-rich loci suggesting a role in local sequence composition in directing GR to its genomic binding sites and thereby contributing to GR-specific gene regulation. Remarkably, receptor-specific gene regulation was also observed near sites that are occupied by both receptors. A genomic deletion of these sites in their endogenous context indeed resulted in a loss of regulation of the nearby gene validating that these sites are essential for transcriptional activation. To investigate how the receptors direct differential gene regulation from shared binding sites I performed STARR-seq, an episomal reporter assay, and compared the activity of AR and GR at occupied genomic enhancers. I found receptor-specific enhancer activation at some shared binding sites suggesting that receptor-specific gene regulation can be driven by distinct abilities to activate genomic enhancers. Finally, to explore if differential enhancer activation can be a consequence of different interactions with transcriptional cofactors, I compared the cofactors recruited by AR and GR. The analysis revealed that proteins from the mediator complex as well as enzymes harboring acetyltransferase activity are specifically enriched among the GR interactors. This demonstrates that functional diversity at sites occupied by both receptors could be driven by differential cofactor recruitment. Together, I found that differences in gene regulation by AR and GR can be driven by the sequence composition as well as distinct abilities to bind closed chromatin. Moreover, gene regulation can be driven by mechanisms downstream of binding, such as differential enhancer activation and cofactor recruitment. These observations might potentially apply to other paralogous transcription factors and help explain how related proteins achieve functional diversification despite similar DNA sequence preferences. Moreover, the model system I have generated provides a valuable setup to further study different mechanisms of signaling by AR and GR in the future.
Der Androgenrezeptor (AR) und Glukokortikoidrezeptor (GR) sind eng verwandte Transkriptionsfaktoren, die unterschiedliche biologische Funktionen haben, aber nahezu identische DNA-Bindestellen erkennen. Um dieses Paradoxon besser zu verstehen, habe ich den Einfluss der genomischen Bindung, der Chromatin-Umgebung und der Interaktionen mit Cofactoren auf die rezeptorspezifische Genregulation untersucht. Um die Unterschiede der Rezeptoren in einem identischen zellulären Kontext zu untersuchen, erzeugte ich eine U2OS-Zelllinie, die AR stabil exprimiert und verglich sie mit der bestehenden GR-exprimierenden U2OS-Zelllinie. Die Aktivierung der Rezeptoren zeigte die Expression sowohl rezeptorspezifischer als auch gemeinsamer Zielgene. Es zeigte sich, dass die rezeptorspezifische Genexpression zum Teil aus subtilen Unterschieden in der DNA-Bindung der Rezeptoren resultiert. Um zu untersuchen, ob Unterschiede in der DNA-Bindung eine Folge von unterschiedlichen Fähigkeiten an geschlossenes Chromatin zu binden sind, führte ich ATAC-seq in beiden Zelllinien durch. Die Analyse ergab, dass GR die Fähigkeit besitzt an geschlossenes Chromatin zu binden, was wiederum eine GR-spezifische Bindung und Genregulation auslöst. Um zu verstehen, ob die Sequenzzusammensetzung einen Einfluss auf die differentielle Bindung hat, verglich ich außerdem die genomischen Loci, die selektiv von einem der Rezeptoren besetzt werden. GR zeigte im Vergleich zu AR eine deutliche Präferenz für GC-reiche Loci. Dies deutet darauf hin, dass die lokale Sequenzzusammensetzung einen Einfluss auf die DNA-Bindung von AR und GR hat und damit zur rezeptorspezifischen Genregulation beiträgt. Bemerkenswerterweise wurde eine rezeptorspezifische Genregulation auch in der Nähe von Bindestellen beobachtet, die von beiden Rezeptoren gleichermaßen besetzt sind. Eine genomische Deletion dieser Bindestellen in ihrem endogenen Kontext führte tatsächlich zu einem Verlust der Regulation des nahegelegenen Gens, was bestätigt, dass die Bindestellen für die Aktivierung dieses Gens verantwortlich sind. Um zu untersuchen, wie die Rezeptoren eine differenzielle Genregulation von gemeinsamen Bindestellen aus erreichen, habe ich mithilfe von STARR-seq die Aktivierung genomischer Enhancer durch die beiden Rezeptoren verglichen. Ich fand heraus, dass AR und GR eine rezeptorspezifische Enhancer-Aktivierung an einigen gemeinsamen Bindestellen aufweisen. Dies deutet darauf hin, dass eine rezeptorspezifische Genregulation aus unterschiedlichen Fähigkeiten der Enhancer-Aktivierung resultieren kann. Um zu untersuchen ob Unterschiede bei der Enhancer-Aktivierung durch AR und GR möglicherweise eine Folge unterschiedlicher Interaktionen mit Cofaktoren sind, habe ich untersucht, ob die Rezeptoren Unterschiede bei der Cofaktorrekrutierung aufweisen. Die Analyse zeigte, dass der Mediator-Komplex sowie einige Acetyltransferasen spezifisch mit GR interagieren. Dies deutet darauf hin, dass Unterschiede in der Genregulation eine Folge von unterschiedlichen Interaktionen von AR und GR mit Cofaktoren sind. Zusammenfassend habe ich herausgefunden, dass die Sequenzzusammensetzung der DNA sowie unterschiedliche Fähigkeiten geschlossenes Chromatin zu binden einen Einfluss auf die rezeptor- spezifische Genregulation von AR und GR haben. Darüber hinaus kann eine differentielle Genregulation aus unterschiedlichen Interaktionen mit Cofaktoren resultieren. Diese Beobachtungen sind möglicherweise auch auf weitere verwandte Transkriptionsfaktoren übertragbar und können dazu beitragen, zu erklären, wie Proteine trotz ähnlicher Präferenzen für die DNA-Sequenz spezifische Funktionen erreichen. Darüber hinaus bietet das von mir erzeugte Modellsystem die Möglichkeit, verschiedene Mechanismen von AR und GR in Zukunft weiter zu untersuchen.
