White-nose syndrome, or white-nose disease, is a fungal disease that is fatal to North American bats. The pathogen, a psychrophilic fungus called Pseudogymnoascus destructans, infects bats during hibernation. It grows on the animals while they are in torpor - a state in which all physiological functions including the immune system are downregulated. The fungus infests all hairless body parts and invades deep into the skin layers where it causes great damage. It has been observed that infected bats arouse more often from torpor than normal in order to clean off the fungus and elicit an immune response. Due to the increased energy consumption resulting from the multiple arousals and the attempts to mount an immune response, the animals prematurely deplete their fat reserves, which are essential for survival during hibernation, ultimately leading to death. Since the 2006 outbreak near New York, the fungus has spread across half of the North American continent and several million bats have died. The pathogen fungus P. destructans was also discovered on bats in Europe and Asia after the disease became known in North America. However, no increased mortality in relation to the fungus has been observed in Europe so far, and ring recaptures proved that individuals survive the fungal infections even over several winter periods. Molecular genetic analyses have shown that the P. destructans is native to Europe and has been carried to North America, under unknown circumstances. Historical data sources have also shown that the fungus has been present on bats in Europe for at least 100 years. Therefore, it is reasonable to assume that European bats have already evolved defences to the fungal disease, while American bats still lack this adaptation. To shed light on the question what mechanisms enable European bats to survive P. destructans infections, the present work investigated physiological and immunological responses occurring in fungus-infected European hibernating bats. For this purpose, I studied greater mouse-eared bats (Myotis myotis) in laboratory and field experiments, as this species is most frequently infected with P. destructans in Europe. Since previous attempts failed to effectively infect greater mouse-eared bats with P. destructans in the laboratory, I mimicked a fungal infection under laboratory conditions in a first experiment (Chapter 1) by subcutaneously inoculating zymosan into the bats. This substance is often used as a fungal antigen in laboratory experiments to elicit antifungal immune responses. Skin temperature recordings from data loggers attached to the bats revealed that the animals did not respond to zymosan with fever or with more frequent arousals, and blood levels did not show excessive immune responses - contrasting to American bats which are infected with P. destructans. However, I found that although the animals treated with zymosan did not react with an adequate immune response as would be expected outside of the hibernation period (e.g., change in white blood cell concentration and composition), they did only respond with an increase in haptoglobin, an acute-phase protein that is secreted during inflammatory responses and is effective against microbial pathogens. From the results, I concluded that there seems to be a hibernation-adapted immune response in great mouse-eared bats that allows them to limit the negative effects of infection with pathogens such as P. destructans without completely eliminating the pathogen to conserve energy (tolerance response). This moderate immune response apparently occurs during regular arousals without change in their duration or frequency. This reaction could be a general adaptation for the hibernation period, whereas a full immune response and recovery does not occur until the following spring, when sufficient food or energy resources are available. To perform immunological studies on bats which are actually infected with P. destructans, I conducted a field experiment (Chapter 2). Thus, I first placed temperature loggers on wild hibernating greater mouse-eared bats before any visible fungal infections could be observed. After approximately one month, I revisited the hibernacula to determine disease symptoms of the bats, retrieved the temperature loggers, and collected blood samples. Based on the cutaneous temperature recordings and the documented disease symptoms, I was able to show that the greater mouse-eared bats continued their hibernation despite fungal infections and also did not show fever symptoms, as is the case with North American bats. In addition, I found that body weight, an indicator of stored energy in the form of fat, has a decisive influence on how often the animals can arouse from torpor during hibernation period. The heavier the animals, the more frequently they can afford the energy-consuming arousals during which they also reduce the fungus. Interestingly, we found signs of an inflammatory response in the blood of torpid severely infected animals. In doing so, they use baseline concentrations of some immune parameters present in the blood (including haptoglobin) without synthesizing new immunological substances. I assume that the use of baseline concentrations in response to the infection is a strategy to avoid additional arousals which are presumably necessary for protein synthesis since most immune functions are downregulated during torpor. In conclusion, these results also suggest immunological tolerance of European bats to the pathogen P. destructans during hibernation. Additionally, I found tendencies of increased oxidative stress in animals that exhibited severe symptoms of the fungal infection. This result indicates that there is still a need for research on the ultimate cost of white-nose disease in European bats. As a helpful tool for further white-nose disease studies, I developed a non-invasive method (Chapter 3) to assess white-nose disease symptoms on hibernating bats without the need to disturb the animals, as it was the case for previous standard methods. This assessment system, which uses visual classification of the fungal infestation to determine the severity of the disease, was compared and validated against the other invasive standard methods used to date. With the help of this method it is henceforth possible to determine white-nose disease including its severity in torpid animals and due to its non-invasiveness it is even possible to do this with the help of many other bat researchers and conservationists on a large scale and in a standardized way during routine winter censuses, as it is requested on international level.
Das Weißnasen-Syndrom oder auch Weißnasenkrankheit genannt, ist eine für nordamerikanische Fledermäuse tödliche Pilzkrankheit. Der Erreger, ein psychrophiler Pilz namens Pseudogymnoascus destructans, befällt Fledermäuse während der Überwinterung. Er wächst auf den Tieren solange sie im Torpor sind - ein Zustand, in dem alle physiologische Funktionen inklusive des Immunsystems weitgehend heruntergefahren sind. Er befällt alle unbehaarten Körperteile und dringt tief in die Hautschichten ein, wo er große Schäden verursacht. Es wurde beobachtet, dass befallene Fledermäuse öfter als normal aus dem Winterschlaf erwachen, um während dieser Wachphasen sich den Pilz von der Haut zu putzen und eine Immunreaktion hervorzurufen. Durch den erhöhten Energieverbrauch infolge der häufigen Aufwachphasen und das hochfahren des Immunsystems verbrennen die Tiere vorzeitig ihre Fettreserven, die für das Überleben während des Winterschlafes essentiell sind, was letztendlich zum Tode führt. Seit dem Ausbruch der Krankheit im Jahr 2006 in der Nähe von New York hat sich der Pilz über den halben nordamerikanischen Kontinent ausgebreitet und es sind mehrere Millionen Fledermäuse gestorben. Der pathogene Pilz P. destructans wurde nach dem Bekanntwerden der Krankheit in Nordamerika auch auf Fledermäusen in Europa und Asien entdeckt. Allerdings wurde hier bislang keine erhöhte Mortalität durch den Pilz verursacht und Ring-Wiederfunde belegten, dass die Individuen die Pilz-Infektionen selbst über mehrere Winterperioden überleben. Molekular-genetische Analysen haben gezeigt, dass der Pilz in Europa heimisch ist und auf ungeklärtem Wege nach Nordamerika verschleppt worden ist. Auch historische Datenquellen haben gezeigt, dass der Pilz schon seit mindestens 100 Jahren auf Fledermäusen in Europa vorkommt. Deshalb liegt die Annahme nahe, dass Europäische Fledermäuse bereits an die Pilzkrankheit angepasst sind, während den amerikanischen Fledermäusen diese Anpassung noch fehlt. Um zu untersuchen, welche Anpassungen es europäischen Fledermäusen ermöglicht, die Infektionen mit P. destructans zu überleben, wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, welche physiologischen und immunologischen Reaktionen bei pilzbefallenen winterschlafenden europäischen Fledermäusen auftreten. Hierfür habe ich Große Mausohren (Myotis myotis) in Labor- und Freilandexperimenten untersucht, da diese Art in Europa am Häufigsten mit P. destructans befallen wird. Da es bislang nicht gelungen ist, Große Mausohren im Labor effektiv mit P. destructans zu infizieren, habe ich in einem ersten Experiment unter Laborbedingungen eine Pilzinfektion simuliert (Kapitel 1), in dem ich den Großen Mausohren subkutan Zymosan injiziert habe. Diese Substanz ist ein pilzliches Antigen, welche in Laborversuchen häufig als genutzt wird um antifungale Immunreaktionen auszulösen. Temperaturaufzeichnungen von Datenloggern, die auf den Tieren angebracht waren, haben ergeben, dass die Tiere weder mit Fieber noch mit häufigeren Aufwachphasen auf Zymosan reagierten und auch die Blutwerte zeigten keine übermäßigen Immunreaktionen - anders als bei den amerikanischen Verwandten, die mit P. destructans infiziert wurden. Ich habe festgestellt, dass die mit Zymosan behandelten Tiere zwar nicht mit einer adäquaten Immunreaktion reagierten wie sie außerhalb der Winterschlafphase zu erwarten wäre (z.B. Veränderung der Konzentration und der Zusammensetzung der weißen Blutzellen), jedoch mit einer Erhöhung von Haptoglobin, ein Akute-Phase-Protein, das bei Entzündungsreaktionen ausgeschüttet wird und effektiv gegen mikrobielle Erreger wirkt. Aus den Resultaten schlussfolgerte ich, dass es bei Großen Mausohren eine winterschlaf-angepasste Immunreaktion gibt, die es ihnen erlaubt, die negativen Auswirkungen einer Infektion mit Pathogenen wie P. destructans zu begrenzen, ohne den Erreger komplett zu beseitigen, um Energie zu sparen (Toleranzreaktion). Diese moderate Immunreaktion findet offenbar während regulärer Aufwachphasen statt, ohne dass diese sich hinsichtlich ihrer Dauer oder Häufigkeit verändern. Dies könnte eine generelle Anpassung für die Winterschlafphase sein, während eine vollständige Immunreaktion und eine Heilung erst im darauffolgenden Frühling stattfindet, wenn wieder ausreichend Nahrung bzw. Energieressourcen zur Verfügung stehen. Um immunologische Untersuchungen an Fledermäusen durchzuführen, die tatsächlich mit P. destructans infiziert sind, habe ich ein Freilandexperiment durchgeführt (Kapitel 2). Dafür habe ich zunächst Temperaturlogger auf wildlebenden winterschlafenden Großen Mausohren angebracht - zu einem Zeitpunkt, an dem noch keine Pilzinfektionen sichtbar waren. Nach zirka einem Monat habe ich erneut die Winterquartiere aufgesucht, um Krankheitssymptome der Fledermäuse zu bestimmen, die Temperaturlogger zu entfernten und Blutproben zu entnehmen. Anhand der kutanen Temperaturaufzeichnungen und dem erfassten Krankheitsbild konnte ich zeigen, dass die Mausohren trotz Pilzinfektionen ihren Winterschlaf fortsetzten und auch keinerlei Fiebersymptome zeigten, wie es bei amerikanischen Fledermäusen der Fall ist. Darüber hinaus ließ sich feststellen, dass das Körpergewicht, ein Indikator für die gespeicherte Energie in Form von Fett, einen entscheidenden Einfluss darauf hat, wie oft die Tiere während der Winterschlafperiode aus dem Torpor erwachen können. Je schwerer die Tiere sind, desto häufiger können sie sich die energieaufwändigen Aufwachphasen leisten, in denen sie auch den Pilzbefall reduzieren. Interessanter Weise haben wir in dem Blut der torpiden Tiere festgestellt, dass schwer infizierte Tiere Anzeichen für eine Entzündungsreaktion zeigen. Dabei scheinen Sie Basiskonzentrationen einiger im Blut vorhandenen Immunparameter zu nutzen (u.a. Haptoglobin), ohne neue immunologische Substanzen zu synthetisieren. Ich gehe davon aus, dass die Nutzung dieser Basiskonzentrationen eine Strategie ist, um zusätzliche Aufwachphasen zu vermeiden, die für die Proteinsynthese vermutlich notwendig sind, da die meisten Immunfunktionen während des Torpors herunterreguliert sind. Auch diese Ergebnisse suggerieren eine immunologische Toleranz der europäischen Fledermäuse gegenüber dem Erreger P. destructans während des Winterschlafes. Darüber hinaus habe ich bei den Tieren mit schweren Infektionen Anzeichen für erhöhten oxidativen Stress gefunden. Dies zeigt, dass es noch Forschungsbedarf bei den tatsächlichen Kosten der Weißnasenkrankheit bei Europäischen Fledermäusen gibt. Als hilfreiches Instrument für weitere Untersuchungen der Weißnasenkrankheit habe ich eine nicht-invasive Methode entwickelt (Kapitel 3), mit der man Symptome der Weißnasenkrankheit auf den winterschlafenden Fledermäusen bewerten kann, ohne dass man die Tiere hierfür stören muss - wie es bei bisherigen Standardmethoden der Fall war. Dieses Bewertungssystem, welches mittels visueller Klassifizierung des Pilzbefalls den Schweregrad der Erkrankung ermittelt, wurde mit den anderen bislang verwendeten invasiven Standardmethoden verglichen und validiert. Mit Hilfe der neuen Methode ist es fortan möglich, die Weißnasenkrankheit inklusive ihrer Schweregrade an torpiden Tieren zu bestimmen und aufgrund ihrer Nichtinvasivität ist es sogar möglich, dies mit Hilfe vieler andere Fledermausforscher und -schützer großflächig und standardisiert während routine-mäßiger Winterzählungen zu tun, wie es bereits international gefordert wird.
