The proper identification of anabolic androgenic steroids with GC/MS in anti-doping research remains an important topic and stable isotope labelling is a convenient and straightforward way to increase confidence in detection through mass spectral structure characterization. The different labelling methods for the introduction of [2H9]TMS and 18O presented in this work were shown to be suitable for the interpretation of benzophenone and hydroxy steroid GC/MS data. Together with HRMS and MS/MS experiments, fragmentation pathways were elucidated and unexpected differences to previously described assumptions uncovered for both substance classes. The practical applicability was confirmed with the self-explanatory mass shifts observed in the respective mass spectra and the comparatively fast preparational steps of labelled derivatives even with low amounts of analyte. Especially the newly developed 18O-labelling method proved to be valuable for confirmatory analysis. It can be employed independently from silylation procedures and thus also for LC-MS approaches, and no migratory tendencies as opposed to TMS groups were observed in the mass spectra. All labelling methods described in this work can be performed with the usual laboratory equipment within a few hours. When used for the characterization of unknown metabolites, the number of reference standards required for unequivocal identification, is expected to be narrowed down and unnecessary laborious and time-consuming synthesis avoided. With the help of isotopically labelled derivatives, differences in the mass spectra of structurally closely related analytes can be determined, which plays a role in the characterization of similar metabolic patterns of endogenous and exogenously administered steroids. In these cases, costly gas chromatography-combustion-isotope ratio mass spectrometry (GC/C-IRMS) for compound identification can be reduced to a minimum or even replaced. Future work may focus on metabolite identification with the developed stable isotope labelling methods or fragment ion elucidation of other relevant steroid subclasses, such as 17-alkyl or 1,4-diene steroids. The use of protecting groups may be helpful to establish derivatization procedures to isotopically label every single functional group in steroids separately. Furthermore, the 18O-labelling method can be further optimized to be applicable for other compound classes as well and should also be tested in LC-MS(/MS) approaches.
Die korrekte Identifizierung anaboler androgener Steroide mittels GC/MS in der Anti-Doping-Forschung bleibt ein wichtiges Thema. Die Markierung mit stabilen Isotopen ist dabei eine praktische und vielseitige Herangehensweise für die massenspektrometrische Strukturaufklärung. Die in dieser Arbeit vorgestellten Markierungsmethoden für die Einführung von [2H9]TMS und 18O erwiesen sich als gut geeignet für die Interpretation von Massenspektren von Benzophenonen und Hydroxysteroiden. Zusammen mit hochauflösender Massenspektrometrie und MS/MS-Experimenten konnten Fragmentierungswege aufgeklärt und unerwartete Unterschiede zu bereits beschriebenen Annahmen für beide Substanzklassen aufgedeckt werden. Die praktische Anwendbarkeit der Markierungsmethoden wurde u. a. durch die selbsterklärenden Massenverschiebungen, die in den jeweiligen Massenspektren beobachtet wurden, bestätigt. Zusätzlich stellt die einfache und schnelle Erzeugung markierter Derivate, die selbst bei sehr geringer Substanzmenge gelang, einen großen Vorteil dar. Insbesondere die neu entwickelte 18O-Markierungsmethode erwies sich als wertvoll für die Strukturbestätigung bestimmter Fragment-Ionen. Diese kann unabhängig von Silylierungsreaktionen, und damit auch für LC-MS Methoden, eingesetzt werden. Außerdem kommt es mit 18O im Gegensatz zu TMS-Gruppen zu keinen Positionsänderungen der Markierung innerhalb des Moleküls Alle in dieser Arbeit beschriebenen Markierungsmethoden können mit der üblichen Laborausrüstung innerhalb weniger Stunden durchgeführt werden. Bei der Charakterisierung unbekannter Metaboliten wird erwartet, dass die Anzahl der für eine eindeutige Identifizierung erforderlichen Referenzstandards reduziert und somit unnötige, aufwändige und langwierige Synthesen vermieden werden können. Mit Hilfe isotopenmarkierter Derivate können Unterschiede in den Massenspektren strukturell eng verwandter Analyten bestimmt werden, was vor allem bei der Charakterisierung ähnlicher Stoffwechselmuster von endogen vorkommenden und exogen verabreichten Steroiden eine Rolle spielt. In diesen Fällen kann die kostspielige gaschromatographische Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie (GC/C IRMS) zur eindeutigen Herkunftsunterscheidung auf ein Minimum reduziert oder sogar ersetzt werden. Mögliche Schwerpunkte zukünftiger Projekte sind die Metaboliten-Identifizierung mit den entwickelten Markierungsmethoden oder die Fragment-Ionen Aufklärung anderer relevanter Steroid-Unterklassen, wie z. B. 17-Alkyl- oder 1,4-Dien-Steroide. Die Verwendung von Schutzgruppen könnte hilfreich sein für die Entwicklung von Derivatisierungsmethoden, mit denen jede einzelne funktionelle Gruppe in Steroiden separat isotopenmarkiert werden kann. Darüber hinaus kann die 18O-Markierungsmethode weiter optimiert werden, um auch für andere Verbindungsklassen anwendbar zu sein, und sollte mit LC-MS(/MS)-Methoden getestet werden.
