Die bei etwa 25% der B-Vorläuferzell akuten lymphoblastischen Leukämien (BVZ-ALL) im Kindesalter zu findende Chromosomentranslokation t(12;21) resultiert in der Bildung des chimären Fusionsproteins ETV6-RUNX1. Trotz des hohen Forschungsinteresses der vergangenen Jahre, basierend auf der hohen Prävalenz der chromosomalen Veränderung, ist diese zur Leukämieentstehung essenziell beitragende Fusion zweier Transkriptionsfaktoren auf molekularer Ebene noch weitestgehend unerforscht. Mit dieser Arbeit soll durch die Etablierung eines Modells zur induzierbaren Repression von ETV6-RUNX1 in BVZ-ALL Zelllinien sowie der systematischen Analyse des JAK-STAT Signalwegs zum besseren Verständnis des Fusionsproteins beigetragen werden.
Hierfür wurden zunächst Rezeptoren des JAK-STAT Signalwegs mittels in silico Analysen, Durchflusszytometrie sowie XTT-Viabilitätsassays untersucht. Anschließend erfolgte nach Klonierung von mehreren shRNA Zielsequenzen gegen ETV6 in ein Plasmid mit einem miR-E enhanced backbone die Auswahl der effektivsten Sequenzen mithilfe eines Reporterzellmodells. Die ausgewählten Plasmide wurden lentiviral in die BVZ-ALL Zelllinien REH, UoC-B6 und AT-2 transduziert. Der knockdown von ETV6-RUNX1 wurde durchflusszytometrisch sowie konfokalmikroskopisch quantifiziert, anschließend erfolgten Wachstumsanalysen, Analysen zur Apoptose sowie immunzytometrische Untersuchungen von Differenzierungsmarkern und Rezeptoren des JAK-STAT Signalwegs.
Es konnten in silico neun verschiedene Rezeptoren des JAK-STAT Signalwegs identifiziert werden, die in ihrer vollen funktionellen Form in den ETV6-RUNX1 positiven Zelllinien REH, UoC- B6, AT-2 sowie in primären ETV6-RUNX1 positiven Blasten exprimiert werden. In den folgenden Analysen bestätigte sich insbesondere für den Interleukin 7 (IL-7) Rezeptor, der aus den Untereinheiten IL-7Rα (CD127) sowie IL2-Rγ (CD132) besteht, die starke Expression und die volle Funktionalität des Rezeptors. Drei Zielsequenzen konnten im Reporterzellmodell für das effektivste silencing von ETV6-RUNX1 identifiziert und erfolgreich in die BVZ-ALL Zelllinie REH transduziert werden. Nach 30 Tagen induzierter shRNA Expression konnte ein intranukleärer knockdown des Fusionsproteins ETV6-RUNX1 auf etwa 8 - 26% nachgewiesen werden. Nach erfolgtem knockdown konnten eine gesteigerte Apoptoserate sowie eine abnehmende Wachstumsgeschwindigkeit beobachtet werden. Ferner wurde nach 38 Tagen induzierter shRNA Expression eine starke Herunterregulation der Untereinheit IL-7Rα (CD127) auf 10 - 14% gemessen.
In dieser Arbeit konnte somit ein vielversprechendes Modell zum kontrollierten und effizienten knockdown des Fusionsproteins ETV6-RUNX1 in REH etabliert werden. Die anhand dieses Modells nachgewiesene verstärkte Apoptoserate sowie die Reduktion der zellulären Wachstumsgeschwindigkeit unterstreichen die wichtige Rolle von ETV6-RUNX1 in der Leukämogenese. Die Effizienz des Modells konnte durch die Abnahme der Expression des IL-7 Rezeptors belegt werden. Die Bedeutung und Mechanismen der Hochregulation von IL-7Rα in ETV6-RUNX1 positiven BVZ-ALL Zelllinien und die Implikationen des IL-7 Rezeptors in der Leukämogenese von ETV6-RUNX1 positiver ALL gilt es nun weiter zu erforschen.
The chromosomal translocation t(12;21), found in approximately 25% of childhood B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia (BVZ-ALL), results in the formation of the chimeric fusion protein ETV6-RUNX1. Many questions remain surrounding this leukemia initiating gene fusion despite great research interest due to its high prevalence rate. This thesis aimed to better understand the effect of the fusion protein by systematically analyzing JAK-STAT signaling in ETV6-RUNX1 positive BVZ-ALL cells and by establishing a model for the inducible silencing of ETV6-RUNX1 in BVZ-ALL cell lines.
Receptors of the JAK-STAT signaling pathway were examined using in silico, flow cytometry and XTT viability analyses. After several shRNA target sequences against ETV6 were cloned into miR-E enhanced backbone plasmids, the most effective sequences were identified using a reporter cell model. The chosen plasmids were lentivirally transduced into the BVZ-ALL cell lines REH, UoC-B6 and AT-2. Protein knockdown of ETV6-RUNX1 was quantified through flow cytometry and confocal microscopy, subsequently analyses of cell growth, apoptosis, cell differentiation and expression of receptors of the JAK-STAT signaling pathway were performed.
Nine different receptors of the JAK-STAT signaling pathway that are expressed in their complete functional form in ETV6-RUNX1 positive cell lines REH, UoC-B6 and AT-2 as well as in primary ETV6-RUNX1 positive blasts were identified. For the interleukin 7 (IL-7) receptor, which consists of the two subunits IL-7Rα (CD127) and IL2-Rγ (CD132), high expression rate and full functionality were observed. Three target sequences for the most effective silencing of ETV6- RUNX1 were identified and successfully transduced into REH cells. After 30 days of induced shRNA expression, an intranuclear knockdown of the fusion protein ETV6-RUNX1 to 8 - 26% was detected. After protein knockdown, an increased apoptosis rate and a decreased growth rate were observed. In addition, downregulation of the subunit IL-7Rα (CD127) to 10 - 14% was detected.
This thesis established a promising model for the controlled and efficient knockdown of the fusion protein ETV6-RUNX1 in REH. The enhanced apoptosis rate and reduction of the cellular growth rate, demonstrated by this model, underline the important role of ETV6-RUNX1 in leukemogenesis. The efficiency of the model was demonstrated by the reduced expression of the IL-7 receptor. The importance and mechanisms of IL-7Rα upregulation in ETV6-RUNX1 positive BVZ-ALL cell lines and the implications of the IL-7 receptor in the leukemogenesis of ETV6- RUNX1 positive ALL need to be further investigated.
