Within the last years, autoimmune encephalitis has become a novel disease group in neurology. The rapidly growing number of newly identified autoantibodies reactive to the central nervous system (CNS) in patients with well-defined clinical syndromes indicate a likelihood of yet broad underestimation of autoimmune pathomechanisms in clinical routines. Diagnostics are still based on testing patient serum or cerebrospinal fluid (CSF) as a whole and the contribution of individual immune cells or antibodies remain unknown although a deeper understanding of underlying cellular and molecular disease mechanisms is indispensable to further develop diagnostic and therapeutic strategies. We therefore strived to isolate single memory B cells (MBCs), non-memory B cells (nMBCs) and antibody-secreting cells (ASCs) out of CSF samples from patients with proven autoreactivity against metabotropic glutamate receptor 5 (mGluR5) or Progranulin with fluorescence-activated single cell sorting. We proposed generating recombinant monoclonal antibodies based on these cells, carrying out a multi-step protocol including polymerase chain reactions (PCRs), sequence analysis, cloning and expression of antibodies in human embryonic kidney cells (HEK cells). To identify clones binding to mGluR5 and Progranulin, respectively, generated antibodies were tested on murine brain slices and in cell-based assays. Furthermore, Fab antibody fragments were created and tested for their ability to displace harmful full antibodies on murine brain sections. We succeeded in cloning cells from CSF samples and proved reactivity against mGluR5 for five recombinant monoclonal antibodies, albeit for none against Progranulin. We provide a characterization of this polyclonal immune response against mGluR5 including genetic information about the reactive clones. Moreover, we describe various other reactivities identified among the monoclonal antibodies. We demonstrate that Fab fragments can displace full IgG antibodies with identical antigen-binding sites and are therefore a useful scientific tool for investigation of antibody effects and may even have some potential to remedy noxious antibody effects. Overall we provide a deeper understanding of the immune response in the context of autoimmune encephalitis with reactivity against mGluR5 and Progranulin, respectively. We not only provide theoretical information but also enable thorough investigation of disease mechanisms by supplying monoclonal antibodies for in-depth testing. We furthermore pave the way for investigating Fab fragments for a possible therapeutic potential in autoimmune encephalitis.
In den letzten Jahren hat sich das Spektrum der autoimmunen Enzephalitiden als eine neue Erkrankungsgruppe in der Neurologie etabliert. Die schnell wachsende Anzahl an neu identifizierten ZNS-reaktiven Autoantikörpern bei Patienten mit gut umschriebenen klinischen Syndromen legt nahe, dass die Rolle autoimmuner Pathomechanismen im klinischen Alltag noch immer deutlich unterschätzt wird. Diagnostische Verfahren stützen sich noch immer auf die Untersuchung von Serum oder Liquor als Gesamtprobe und die Rolle einzelner zellulärer Komponenten und Antikörper bleibt unklar, obwohl ein tiefgreifenderes Verständnis für zugrundeliegende zelluläre und molekulare Mechanismen notwendig ist um Strategien für Diagnostik und Therapie weiterzuentwickeln. Unser Ziel war es daher, mittels Fluoreszenz-aktivierter Einzelzellsortierung CD27-positive und CD27-negative B-Zellen, sowie Antikörper-sezernierende Zellen aus Liquorproben von Patienten mit nachgewiesener Auto-Reaktivität gegen mGluR5 oder Progranulin zu isolieren. Wir führten ein mehrschrittiges Protokoll durch, welches Polymerase-Kettenreaktionen, Sequenzanalysen, Klonierung und die Expression von rekombinanten monoklonalen Antikörpern in HEK-Zellen umfasst. Um jene Klone zu identifizieren, die die gesuchte Reaktivität gegen mGluR5 beziehungsweise Progranulin aufweisen, testeten wir die generierten Antikörper auf Maushirnschnitten und transfizierten HEK-Zellen. Darüber hinaus untersuchten wir, ob Fab-Antikörperfragmente schädliche Antikörper im Rahmen einer autoimmunen Enzephalitis verdrängen können. Wir isolierten erfolgreich Zellen aus den Liquorproben der Patienten und bewiesen für fünf derer rekombinanten monoklonalen Antikörper eine Reaktivität gegen mGluR5, konnten jedoch keine Progranulin-reaktiven Antikörper generieren. Wir charakterisieren hier diese polyklonale Immunantwort gegen mGluR5 unter Analyse der genetischen Informationen der reaktiven Klone. Auch konnten wir andere Reaktivitäten der isolierten Zellen rekonstruieren und stellen diese dar. Des Weiteren zeigen wir, dass Fab-Antikörperfragmente ein nützliches Tool zur Untersuchung von Antikörpereffekten sind und mit ganzen Antikörpern um Bindungsstellen konkurrieren, wodurch sie möglicherweise auch ein gewisses Potential aufweisen, Effekte schädlicher Antikörper abzuwenden. Zusammenfassend ermöglichen wir mit dieser Arbeit ein tiefgreifenderes Verständnis für die Immunreaktion im Rahmen einer autoimmunen Enzephalitis gegen mGluR5 beziehungsweise Progranulin. Wir stellen hierbei nicht nur theoretische Informationen zur Verfügung, sondern ermöglichen mit unseren monoklonalen Antikörpern weiterführende Experimente um Pathomechanismen zu untersuchen. Wir ebnen außerdem den Weg um ein mögliches therapeutisches Potential von Fab-Antikörperfragmenten für autoimmune Enzephalitiden zu untersuchen.
