The tight junction (TJ) protects the intestinal barrier function and controls the paracellular transport of water, ions, small water-soluble molecules, and macromolecules. The structure of the TJ comprises the belt-like meshwork of the TJ strands between two epithelial cells, called the bicellular TJ (bTJ), and the vertically converged central tube by the most apical bTJs in the region where three or more cells meet, termed tricellular TJ (tTJ). The tTJ is assumed to be a weak spot of the intestinal epithelial barrier due to the presumed space left in the central tube. Major components of the tTJ are tricellulin and the three members of the angulin family. Tricellulin regulates the passage of macromolecules and therefore acts a crucial part in preventing an uncontrolled uptake of pathogens and immunogens from the gut lumen. Angulin-1, -2, and -3 share the ability to recruit tricellulin to the tTJ. In each epithelium, at least one angulin localizes at the tTJ and in colon the major role falls on angulin-1. Dysregulation of TJ proteins could cause or could be caused by corresponding dis-eases due to altered paracellular passage. Inflammatory bowel diseases (IBD) are possibly caused by a dysregulated communication between intestinal epithelial cells and the immune system. IBD has two major subtypes, Crohn’s disease (CD) and ulcerative colitis (UC). In CD, tricellulin was found to have a shifted localization with unaltered expression level while in UC, it was downregulated by IL-13. In this thesis, several aspects dealing with the tTJ and the related regulation in IBD were investigated. First, the expression of angulin-1 was analysed in IBD. Angulin-1 was downregulated in active CD at both mRNA and protein expression levels. For the exploration of the mechanisms behind, three intestinal epithelial cell lines were investigated using cytokines treatments, inhibitors treatments, phosphorylation analysis, and electrophysiological and flux measurements. It turned out that leptin could induce the downregulation of angulin-1 in T84 and Caco-2 cells, and that STAT3 and its upstreaming pathway JAK2 were responsible signaling mechanisms of this regulation. Incomplete blockage of STAT3 activation by the JAK2 inhibitor AG490 suggested an independent pathway bypassing JAK2. An observed increase of permeability for FITC-dextran 4 kDa (FD4) in Caco-2 cells indicated the potency of macromolecular passage caused by angulin-1 downregulation. Findings of this subproject have been published (Hu et al., 2020). In a second project, it was studied whether tricellulin might still be altered in remission of UC at expression level, which subsequently might increase potential antigen uptake and lead to relapse of the inflammation. Intestinal biopsies from patients in UC remission were analysed for the expression of tricellulin as well as for electrophysiological and flux properties. Tricellulin expression in remission UC was not significantly different to controls at both mRNA and protein expression levels. In line with this, transepithelial resistance, epithelial resistance, and subepithelial resistance were all similar between remission UC and healthy controls, along with the comparable permeability for fluorescein and FD4. Analysis of timepoints shortly before occurrence of relapse might show different expression. However, this remains a hypothesis and needs to be further elucidated. A third project focused on the downregulation of tricellulin by IL-13 via AP-1. Promoter studies were performed to analyse the responsible binding sites for this downregulation. Mutation analysis found that the jun binding site – 3473 bp before the start codon – was essential for the regulation. In conclusion, several aspects of the tTJ proteins in IBD were studied and lead to new findings which might serve as basis for therapeutic intervention.
Die Tight Junction (TJ) gewährleistet die intestinale Barrierefunktion und reguliert den parazellulären Transport von Wasser, Ionen, kleinen Soluten und Makromolekülen. Die Struktur der TJ besteht aus der bizellulären TJ (bTJ), dem gürtelartigen Netzwerk von Strängen zwischen zwei Epithelzellen, und der trizellulären TJ (tTJ). Die tTJ bildet einen vertikal konvergierenden „central tube“ von den apikalsten bTJs der Region, in der drei oder mehr Zellen aufeinandertreffen. Es wird angenommen, dass die tTJ eine potentielle Schwachstelle der intestinalen Barriere aufgrund ihrer röhrenartigen Struktur darstellt. Tricellulin und die drei Mitglieder der Angulinfamilie sind die Haupt-Proteinbestandteile der tTJ. Tricellulin reguliert in reziproker Weise die Passage von Makromolekülen und spielt dadurch im Darm eine entscheidende Rolle bei der Verhinderung der unkontrollierten Aufnahme von Antigenen aus dem Lumen. Die Angulin-1, -2 und -3 besitzen die Fähigkeit, Tricellulin zur tTJ zu rekrutieren. In allen tTJs ist mindestens ein Angulin lokalisiert und im Kolon spielt Angulin-1 die Hauptrolle. Eine Dysregulation von TJ-Proteinen könnte entsprechende Erkrankungen aufgrund einer veränderten parazellulären Passage verursachen oder durch diese verursacht werden. Chronischentzündliche Darmerkrankungen (CED) werden möglicherweise durch eine dysregulierte Kommunikation zwischen Darmepithelzellen und dem Immunsystem verursacht. Die zwei Haupttypen der CED sind Morbus Crohn (MC) und Colitis ulcerosa (CU). Bei MC wurde eine veränderte Lokalisation von Tricellulin bei unverändertem Expressionsniveau gefunden, während es bei CU durch Interleukin-13 (IL-13) in der Expression herunterreguliert wurde. In dieser Arbeit wurden verschiedene Aspekte, die sich mit der tTJ und der damit relevante Regulierung in der CED befassen, untersucht. Zunächst wurde die Expression von Angulin-1 bei CED analysiert. Angulin-1 wurde in der aktiven MC sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinexpressionsebene herunterreguliert. Zur Erforschung der zugrunde liegenden Mechanismen wurden drei Darmepithelzelllinien verwendet, wobei Zytokin- und Inhibitorbehandlungen, Phosphorylierungsanalysen sowie Elektrophysiologische- und Fluxmessungen durchgeführt wur-den. Es stellte sich heraus, dass Leptin die Herunterregulierung von Angulin-1 in T84- und in Caco-2-Zellen induzieren konnte und dass STAT3 und sein Upstream-Signal-weg JAK2 für die Signalmechanismen dieser Regulation verantwortlich waren. Die unvollständige Blockierung der STAT3-Aktivierung durch den JAK2-Inhibitor AG490 deutete auf einen unabhängigen Signalweg hin, der JAK2 umgeht. Ein beobachteter Anstieg der Permeabilität für FITC-Dextran 4 kDa (FD4) in Caco-2-Zellen zeigte die Potenz der makromolekularen Passage an, die durch die Herunterregulierung von Angulin-1 verursacht wird. Die Ergebnisse dieses Teilprojekts wurden publiziert (Hu et al., 2020). In einem zweiten Projekt wurde untersucht, ob Tricellulin bei der Remission von CU auf Expressionsebene noch verändert sein könnte, und ob die potenzielle Antigenaufnahme anschließend erhöht und durch die einem Schub der Entzündung verursacht wird. Darmbiopsate von Patienten in Remission einer CU wurden auf die Expression von Tricellulin sowie mittels elektrophysiologischen und Fluxmessungen untersucht. Die Expression von Tricellulin in Remission der CU war sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinexpressionsebene nicht signifikant von gesunden Kontrollen verschieden. Dementsprechend waren der transepitheliale Widerstand, der epitheliale Widerstand und der subepitheliale Widerstand zwischen Remission der CU und gesunden Kontrollen ähnlich, ebenso wie die Permeabilität für Fluorescein und für FD4. Zeitpunkte kurz vor dem Schub konnten im Rahmen dieser Arbeit nicht untersucht werden. Ob sich zu diesem Zeitpunkt unterschiedliche Ausprägungen zeigen, muss daher noch aufgeklärt werden. Ein drittes Projekt konzentrierte sich auf die bereits beschriebene Herunterregulierung von Tricellulin durch IL-13 über AP-1. Um die verantwortlichen Bindungsstellen für diese Herunterregulierung zu analysieren, wurden Promotorstudien durchgeführt. Mutationsanalysen ergaben, dass die jun-Bindungsstelle – 3473 bp vor dem Startcodon – für die Regulation wichtig war. Zusammenfassend ist zu sagen, dass mehrere Aspekte der tTJ-Proteine bei der CED untersucht wurden und zu neuen Erkenntnissen führten, die als Grundlage für eine therapeutische Intervention gelten könnten.
