Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (FOP) is a rare disease characterized by episodic bone formation outside of the skeleton (ectopic bone) in soft tissues in a process called heterotopic ossification (HO). Independent of the location and initial triggers, ectopic bone in FOP forms via a complex-multi-stage process, which mimics the developmental process of endochondral bone formation. Bone is a highly vascularized organ and its formation requires a tightly controlled interplay of osteogenesis and angiogenesis. Blocking or loss of pro-angiogenic factors (e.g. VEGFA) impairs bone formation by disturbed angiogenesis and decreased ossification. FOP patient biopsies revealed that HO lesions are highly angiogenic with aberrations in vascular markers and morphology suggesting the involvement of pathological angiogenesis and Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT). However, it remains elusive, which molecular mechanisms orchestrate the vasculature in ectopic bone formation and which signals are responsible for the aberrant vascular phenotype in FOP lesions. FOP is caused by mutations in the BMP type I receptor ALK2 leading to hypersensitive signaling and aberrant SMAD1/5 activation by ActivinA. In FOP mice, blocking of ActivinA prevents HO indicating a central role of this ligand in the disease. Whether signaling responses of Activin or BMP ligands cause the vascular phenotype in human FOP biopsies is unknown. The endothelium represents a fundamental component of the vasculature by forming the initial tubular structure. In the present study a patient derived endothelial cell (EC) model was generated by using induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) in a combinatorial cryopreservation and differentiation method. FOP iECs recapitulated the pathomechanism of aberrant ActivinA/SMAD1/5 signaling and additionally showed aberrant BMP/SMAD2 responses in an ALK2 dependent manner. ActivinA transduced a BMP like response only in FOP iECs and a comprehensive transcriptome analysis identified a FOP-specific genetic profile interlinking ActivinA with BMP/NOTCH pathways, blood vessel formation and EndMT. Collectively, the results propose a model in which ActivinA primes FOP ECs in favor of pathological angiogenesis and EndMT in presence of angiogenic and inflammatory factors as 2nd triggers. ActivinA induced only partial EndMT and alterations in angiogenesis were only observed in presence of VEGFA suggesting a second hit model for pathological endothelial function in FOP lesions. Thus, I propose that the ActivinA induced FOP specific transcriptome (1st trigger) pre-patterns the FOP endothelium and thereby challenges endothelial identity and plasticity, which leads to pathological angiogenesis and EndMT in presence of 2nd triggers. Drug testing in the FOP endothelial disease model demonstrated that the kinase inhibitor Saracatinib rescued aberrant signaling responses and the ActivinA-induced transcriptome in FOP iECs to WT levels, suggesting a preventive effect on pathological vascularization in pre-osseous FOP lesions.
Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (FOP) ist eine seltene Erkrankung, die durch episodische Knochenbildung außerhalb des Skeletts (ektopischer Knochen) gekennzeichnet ist. Der Prozess der Knochenbildung in Weichteilgewebe wird heterotope Ossifikation genannt (HO). Unabhängig von der Lokalisation und den anfänglichen Auslösern bildet sich der ektopischer Knochen bei FOP über einen komplexen, mehrstufigen Prozess, der die endochondrale Knochenbildung nachahmt. Der Knochen ist ein stark vaskularisiertes Organ und seine Bildung erfordert ein eng kontrolliertes Zusammenspiel von Knochen- (Osteogenese) und Blutgefäßbildung (Angiogenese). Die Inhibierung oder der Verlust von pro-angiogenen Faktoren (z.B. VEGFA) beeinträchtigt die Angiogenese und verringert die Knochenbildung. Biopsien von FOP-Patienten enthüllten, dass sich in Läsionen der HO viele Blutgefäße bilden, welche veränderte Markerproteine und Morphologie aufweisen. Dies lässt eine pathologischen Angiogenese und eine Endothelial-mesenchymale Transition (EndMT) vermuten. Es bleibt jedoch unklar, welche molekularen Mechanismen die Blutgefäße während der ektopischen Knochenbildung steuern und welche Signale für den vaskulären Phänotyp in FOP-Läsionen verantwortlich sind. FOP wird durch Mutationen im BMP-Typ-I-Rezeptor ALK2 verursacht, die zu einer hypersensitiven Signalübertragung und einer aberranten SMAD1/5-Aktivierung durch ActivinA führen. In FOP-Mäusen verhindert die Blockierung von ActivinA die HO, was auf eine zentrale Rolle dieses Liganden bei FOP hinweist. Ob Signalübertragungen von Activin- oder BMP-Liganden den vaskulären Phänotyp in menschlichen FOP-Biopsien verursachen, ist unbekannt. Das Endothel stellt eine fundamentale Komponente der Vaskulatur dar und bildet die initiale tubuläre Struktur von Blutgefäßen. In der vorliegenden Studie wurde ein FOP-Endothelzellmodell mittels kombinatorischer Kryokonservierungs- und Differenzierungsmethode generiert. Dafür wurden von FOP Patienten stammende induzierte pluripotente Stammzellen (iPSZ) verwendet. Die aus FOP iPSZ generierten Endothelzellen rekapitulierten den Pathomechanismus der aberranten ActivinA/SMAD1/5-Signalübertragung und zeigten zusätzlich aberrante BMP/SMAD2-Signalantworten in einer ALK2-abhängigen Weise. ActivinA transduzierte eine BMP-ähnliche Antwort nur in FOP Enothelzellen und eine umfassende Transkriptomanalyse identifizierte ein FOP-spezifisches genetisches Profil, das ActivinA mit BMP/NOTCH-Signalwegen, Blutgefäßbildung und EndMT verknüpft. ActivinA induzierte nur teilweise EndMT und veränderte die Angiogenese nur in Gegenwart von VEGFA, was auf ein second hit Modell für die pathologische Endothelfunktion in FOP-Läsionen hindeutet. Auf Basis des second hit Modells wird angenommen, dass ActivinA als erster Auslöser ein FOP-spezifisches Transkriptom induziert, welches das FOP-Endothel vorstrukturiert. In Gegenwart des zweiten Triggers wird die endotheliale Identität und Plastizität herausgefordert und mündet in pathologische Angiogenese und EndMT. Medikamententests im FOP-Endothelmodell zeigten, dass der Kinaseinhibitor Saracatinib die aberranten Signalantworten und das ActivinA-induzierte Transkriptom in FOP-Endothelzellen auf WT-Niveau hält. Dies deutet auf eine präventive Wirkung auf eine mögliche pathologischen Vaskularisierung in frühen FOP-Läsionen hin, bevor der ektopische Knochen entsteht.
