According to the World Health Organization, pneumonia is the 4th most common cause of death worldwide. The main cause of community-acquired pneumonia (CAP) is the bacterium Streptococcus pneumoniae (S.pn.). Acute respiratory failure is a major complication of severe pneumococcal pneumonia, characterized by severe damage of the alveoli resulting in pulmonary edema. Pneumolysin (PLY), a pore-forming toxin which is produced by S.pn., is thought to contribute to edema formation. In alveolar epithelial cells, PLY pore formation leads to rapid mitochondrial calcium ([Ca2+]m) influx resulting in loss of mitochondrial membrane potential, mitochondrial fragmentation, activation of executioner caspases-3/7 and finally cell death. Survival of alveolar epithelial cells after PLY challenge might contribute to limited mortality and morbidity following S.pn.-mediated CAP. However, it is currently unknown which cellular parameters determine whether alveolar epithelial cells are able to survive after PLY challenge. The aim of the present study was thus to investigate the survival of alveolar epithelial cells after PLY challenge and characterize cellular parameters associated with cell survival in vitro. The alveolar epithelial cell line A549 and primary alveolar epithelial type II cells were investigated after PLY challenge for 18 hours using live-cell imaging. By establishing a machine learning-based single cell analysis method, it was possible to longitudinally track individual cells and relate cellular parameters, including cell survival and caspase-3/7 activation, with the above mentioned mitochondrial parameters as well as further cellular parameters such as autophagy induction. Surprisingly, a significant number of alveolar epithelial cells survived the PLY challenge despite having shown clear caspase-3/7 activation. Cells were able to recover from mitochondrial fragmentation, loss of mitochondrial membrane potential and drop down of mitochondrial ATP production. The in-depth analysis of mitochondria on a single cell level identified the [Ca2+]m influx amplitude and [Ca2+]m efflux rate as decisive parameters for survival after PLY challenge. Accordingly, inhibition of [Ca2+]m efflux resulted in a decrease of surviving A549 cells. Further findings indicated that induction of autophagy might be important for the survival of alveolar epithelial cells after PLY challenge. In summary, regulation of [Ca2+]m was identified as a critical parameter for controlling cell survival after PLY challenge in alveolar epithelial cells in vitro. This might serve as useful insight for future therapies to prevent and treat severe pneumococcal pneumonia by limiting alveolar damage.
Laut Weltgesundheitsorganisation ist die Pneumonie weltweit die vierthäufigste Todesursache. Der häufigste Erreger der ambulant erworbenen Pneumonie ist das Bakterium Streptococcus pneumoniae (S.pn.). Schwere Pneumokokkenpneumonien können ein akutes Lungenversagen verursachen, das durch diffuse Alveolarschäden mit nachfolgendem Lungenödem charakterisiert ist. Es wird angenommen, dass das porenbildende S.pn. Toxin Pneumolysin (PLY) entscheidend zur Lungenödembildung beiträgt. Die Porenbildung durch PLY verursacht in Alveolarepithelzellen einen schnellen Calciumeinstrom in die Mitochondrien. Dies führt zu einem Verlust des mitochondrialen Membranpotentials, zu mitochondrialer Fragmentierung, zur Aktivierung der Effektorcaspasen-3/7 und schließlich zum Zelltod. Ein Überleben von Alveolarepithelzellen nach PLY-Exposition könnte jedoch die Pneumokokkenpneumonie-assoziierte Mortalität und Morbidität reduzieren. Allerdings ist bisher unbekannt, welche zellulären Parameter zum Überleben von Alveolarepithelzellen nach PLY-Exposition beitragen. Ziel dieser Arbeit war es, das Überleben von Alveolarepithelzellen nach PLY-Exposition in vitro zu untersuchen und zelluläre Parameter zu bestimmen, die mit dem Überleben von Alveolarepithelzellen nach PLY-Exposition assoziiert sind. Dazu wurden A549-Zellen und primäre Alveolarepithelzellen Typ II nach PLY-Exposition in vitro über einen Zeitraum von 18 h mittels Lebendzellmikroskopie untersucht. Die durch maschinelles Lernen optimierte Bildanalyse ermöglichte die kontinuierliche longitudinale Beurteilung des Zellüberlebens und der Caspase-3/7-Aktivierung individueller Zellen sowie die Korrelation mit den oben genannten mitochondrialen Parametern und der Autophagie¬induktion in einzelnen Zellen. Überraschenderweise konnten Zellen identifiziert werden, die eine PLY-Exposition trotz deutlicher Caspase-3/7-Aktivierung überlebten. Die A549-Zellen erholten sich von mitochondrialer Fragmentierung, Verlust des mitochondrialen Membranpotentials sowie der Abnahme mitochondrialer ATP-Produktion. Die Analyse der Mitochondrien auf Einzelzell-ebene identifizierte eine niedrigere Amplitude des initialen Calciumeinstroms in die Mitochondrien sowie einen folgenden schnelleren Calciumausstrom aus den Mitochondrien als entscheidende Parameter für das Überleben nach PLY-Exposition. Entsprechend führte die Hemmung des mitochondrialen Calciumausstroms zu vermehrtem Zelltod. Zudem gibt diese Studie erste Hinweise darauf, dass der zelluläre Prozess der Autophagieinduktion für das Überleben von Alveolarepithelzellen nach PLY-Exposition relevant ist. Schlussfolgernd stellt sich die mitochondriale Calciumregulation als ein entscheidender Parameter für die Kontrolle des Überlebens gegenüber Zelltod von Alveolarepithelzellen nach PLY-Exposition in vitro dar. Diese neuen Erkenntnisse könnten einen therapeutischen Ansatz bieten, um Alveolarschäden zu begrenzen und dadurch den Ausgang schwerverlaufender Pneumokokkenpneumonien zu verbessern.
