Background: Differences in enzymatic activity and pathogenic impact of Porphyromonas gingivalis (P. g.) peptidylarginine deiminase (PPAD) for development of rheumatoid arthritis (RA) have been published, confounded by different PPAD enzymes and methods used. P. g. is involved in triggering self-reactive immune responses. An enzymatic active PPAD (RACH2007-PPAD) was isolated from an RA patient (CH2007) and linked to bacterial infection, citrullination of major RA autoantigens, RA onset, RA diagnosis, and RA lung involvement. Methods: Recombinant RACH2007-PPAD was cloned, verified by DNA sequencing and expressed in Escherichia coli. The purified RACH2007-PPAD and its enzymatic activity was analysed using 2D-electrophoresis, mass spectrometry (MS), immunoblot and ELISA. Natural P.g.CH2007 vesicles were isolated by centrifugation method and their enzymatic activity was analysed. The autoantibody response to various citrullinated RACH2007-PPAD proteins, peptides and RACH2007-PPAD itself was recorded and bioinformatically evaluated. Results: RACH2007-PPAD autocitrullinates amino acid position 63 (aa63) and exhibits so far two new amino acid mutations (aa73 F to L) and (aa447 E to V). RACH2007-PPAD internally citrullinated fibrinogen, vimentin, hnRNP-A2/B1, and histone H1 recognised by RA sera and specific α-citrulline monoclonal antibodies, identifying a common RG/RGG consensus motif. In 20% of RA patients we identified an increased antibody reactivity for α-cit-RACH2007-PPAD after RA onset (n=30) and antibody levels were correlated with Rheumatoid factor levels and age. High antibody reactivities (77%) against the cit-specific signal CPP derived from the autocitrullination site (R63) we detected in RA patient sera (n=99), 48% of them were seronegative. A human 458 RA autoantigen protein-macroarray was citrullinated by RACH2007-PPAD and probed with RA patient sera (n=6) and OA patient sera as controls (n=4). 16 RA autoantigens and 9 autoantigens associated with lung diseases were identified. 5 (FGB, FGG, HARS, HSP90, SRP14) have previously been described as RA autoantigens in interstitial lung disease (ILD). Anti-cit-specific anti-RA-PPAD peptide response is a major determinant in parenchymal changes (p=0.018; n=106) in the lung at time of RA diagnosis. Conclusions: Specific RACH2007-PPAD from P.g.CH2007 induced internal citrullination of major RA autoantigens and has immunological and diagnostic relevance in early RA and for onset of RA. Anti-cit- RACH2007-PPAD and anti-CPP levels correlated with ACPA levels, and citrullination of ILD autoantigens supporting an infection based concept of induction of ACPAs in the human lung and synovial tissue.
Ziele: Es wurden Unterschiede in der enzymatischen Aktivität und dem pathogenen Einfluss von Porphyromonas gingivalis (P. g.) Peptidylarginin-Deiminase (PPAD) auf die Entstehung der rheumatoiden Arthritis (RA) veröffentlicht. Diese Diskrepanzen werden durch die Verwendung unterschiedlicher PPAD-Enzyme und Modifikations-Methoden unterstützt. Es wird diskutiert, ob Infektionen, wie z. B. durch P. g., an der Auslösung und Verstärkung von Autoimmunreaktionen beteiligt sind. An der Peptidylarginin-Deiminase aus P.g.CH2007 (RACH2007-PPAD) von einem Patienten (CH2007) mit rheumatoider Arthritis (RA) und einem synthetischen PPAD-Peptid (CPP), das die Hauptautocitrullinierungsstelle enthält, wurde der potentielle Zusammenhang zwischen bakterieller Infektion, Citrullinierung von RA-Autoantigenen, -Beginn, -Diagnose und RA mit Lungenbeteiligung untersucht. Methoden: Eine rekombinante RACH2007-PPAD wurde kloniert, die DNA sequenziert bzw. analysiert und das Protein in Escherichia coli exprimiert. Die gereinigte RACH2007-PPAD und ihre enzymatische Aktivität wurden mittels 2D-Elektrophorese, Massenspektrometrie, Immunoblot und ELISA analysiert. Native P.g.CH2007-Vesikel wurden durch mehrere Zentrifugationsschritte isoliert und auf ihre enzymatische Aktivität hin überprüft. Eine Autoantikörperantwort auf verschiedene RACH2007-PPAD-citrullinierte Proteine und Peptide sowie die RACH2007-PPAD selbst wurden untersucht und bioinformatisch ausgewertet. Ergebnisse: RACH2007-PPAD autocitrullinierte die Aminosäureposition aa63 und zeigte in der massenspektrometrischen Analyse zwei noch unbekannte Aminosäure-Mutationen an Position aa73 und aa447 auf. RACH2007-PPAD citrullinierte Fibrinogen, Vimentin, hnRNP-A2/B1 und Histone H1 innerhalb des nativen Proteins mit einer bestimmten RG/RGG-Erkennungsregion und wird von RA-Seren und spezifischen monoklonalen Anti-Citrullin-Antikörpern detektiert. Bei 20 % der RA-Patienten stellten wir eine erhöhte Antikörper-Reaktivität für anti-cit-RA CH2007-PPAD nach Ausbruch der RA fest (n=30). Die Antikörperspiegel korrelierten mit den Rheumafaktorwerten und dem Alter. Hohe Antikörper-Reaktivitäten (77 %) konnten wir für die spezifischen Citrulline im CPP, welches die identifizierte Autocitrullinierungsstelle (R63) enthält, in RA-Seren (n=99) nachweisen, wovon 48 % sero-negative RA-Patienten waren. Ein humaner RA-Autoantigen-Protein-Macroarray (Antigene = 458) wurde mit RACH2007-PPAD citrulliniert und anschließend mit Seren von RA-Patienten (n=6) und OA-Patienten (n=4) detektiert. Es wurden 16 bekannte RA-Autoantigene und neun Antigene, die mit Lungen-Krankheiten assoziiert sind, gefunden. Fünf (FGB, FGG, HARS, HSP90, SRP14) der detektierten Antigene wurden bereits als RA-Autoantigene mit der interstitiellen Lungenerkrankung (ILD) in Zusammenhang gebracht. Die anti-Citrullin-spezifische CPP-Reaktion ist eine wichtige Determinante bei parenchymalen Veränderungen in der Lunge (p=0,018; n=106) zum Zeitpunkt der RA-Diagnose. Schlussfolgerungen: Die RACH2007-PPAD ist in der Lage, die wichtigsten RA-Autoantigene intern zu citrullinieren, und hat eine immunologische und diagnostische Bedeutung in der frühen Form der RA und zum Zeitpunkt des Ausbruchs der Krankheit. Anti-Cit-RACH2007-PPAD und die Anti-CPP-Level korrelieren mit den ACPA-Spiegeln und unterstützen ein infektionsbasiertes Konzept zur Induktion von ACPAs in der Lunge und im Synovialgewebe.
