Hintergrund: Dysferlinopathie ist eine seltene, autosomal-rezessiv vererbte Muskelkrankheit verursacht durch Mutationen im Dysferlin-Gen. Das Membranprotein Dysferlin ist an Kalziumabhängigen Reparaturprozessen von Membranmikroläsionen beteiligt. Ein Drittel der Mutationen sind Missense-Mutationen, die zur Fehlfaltung, zum vorzeitigen Abbau sowie zu einer intrazellulären Akkumulation von Proteinen führen können. Kleine (10 Aminosäuren) Dysferlinspezifische Peptide mit einer angefügten zellpenetrierenden Sequenz (TAT-Sequenz) ermöglichen in vitro in Muskelzellen von Dysferlinopathie-Patienten eine Relokalisation des mutierten Dysferlins an die Muskelmembran und seine Funktionswiederherstellung. Systemisch applizierte TAT-Peptide zeigen jedoch eine unspezifische Biodistribution, einen schnellen Abbau und eine rasche Exkretion. Nanopartikel sollten in diesem Projekt als Wirkstofftransportsysteme untersucht werden. Eisenoxid-Nanopartikel (SPION) ermöglichen zusätzlich die bildgebende Lokalisierung (Magnetresonanztomographie) und die magnetische Steuerung ins Zielgewebe.
Methodik: TAT-Peptide wurden an zwei unterschiedliche SPION gekoppelt: Very small iron oxide particles (VSOP) und Ferumoxytol. Die reversible Beladung basierte auf eine elektrostatische Adsorption der Peptide auf den Nanopartikeln. Eine Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen diente der Detektion der Peptide im Zielgewebe bzw. in den Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie und den in-vitro-Untersuchungen der Nanopartikel.
Für die Bestimmung der Beladungskapazität der Nanopartikel sowie deren Stabilität in Wasser und unter physiologischen Bedingungen (physiologische Pufferlösung, Serum) wurde die Größe sowie die Fluoreszenzauslöschung und Relaxivität der beladenen Nanopartikel in unterschiedlichen Suspensionsmedien in vitro untersucht. Die Nanopartikelstabilität wurde im Serum mittels Relaxivitäts- und Fluoreszenzmessungen sowie mittels Agarose-Gelelektrophorese untersucht. In Zellkultur wurde die Verträglichkeit und Peptidabgabe in vitro analysiert. In einem Dysferlinopathie-Mausmodell wurde nach i.v.-Verabreichung eine orientierende Bluthalbwertszeit einzelner Nanopartikel fluoreszenzphotometrisch mit Blutproben ermittelt. Zusätzlich wurde der histologische Nachweis im Zielgewebe untersucht.
Ergebnisse: Es konnte gezeigt werden, dass eine Beladung durch elektrostatische Adsorption von kleinen TAT-Peptiden auf SPION möglich ist. VSOP und Ferumoxytol ließen sich mit je 3 und 16 Peptide stabil beladen. Die Suspensions- und Adsorptionsstabilität wurde stark von externen Faktoren (Ionenstärke, Serumproteine) beeinflusst. Die Peptidadsorption blieb reversibel und diese wurden in biologischen Suspensionsmedien abgegeben. Beladene VSOP zeichnete sich im Vergleich zu Ferumoxytol durch eine stärkere Peptidadsorption aus, aber tendierte mehr zur Aggregation in biologischen Suspensionsmedien.
Die ermittelte Bluthalbwertszeit der SPION-Peptid-Partikel war kürzer als die der unbeladenen SPION. Histologisch ließen sich die Nanopartikel im Zielgewebe mittels Fluoreszenzmikroskopie nicht darstellen. Fluoreszenzphotometrisch gelang der Nachweis von geringen Mengen an Peptide in lysierten Muskelproben.
Schlussfolgerung: Trotz erfolgreicher elektrostatischer Peptidbeladung der Nanopartikel bleibt die Stabilität und kontrollierte Wirkstoffabgabe problematisch. Für den Einsatz in vivo stellen zusätzlich die Biodistribution und Bluthalbwertszeit der beladenen SPION große Herausforderungen dar. Zudem sind die spezifischen physiologischen Gegebenheiten im Zielgewebe entscheidend für den Erfolg des Wirkstofftransportes.
Background: Mutations in the dysferlin gene cause Dysferlinopathy, a rare autosomal recessive muscle-disease. Dysferlin is a membrane-bound protein involved in the calcium-dependent repair of sarcolemmal microlesions. One third of all mutations are missense mutations leading to protein misfolding, premature protein degradation and intracellular protein accumulation. Small (10 amino-acids) dysferlin-specific peptides coupled to a cell-penetrating sequence (TAT-sequence) allow in vitro the reallocation to the sarcolemma and functional restoration of mutated dysferlin in myotubes from patients. Systemically administered TAT-peptides show nonselective biodistribution, as well as fast degradation and excretion. Therefore, nanoparticles were investigated for this project as drug-delivery-system. Particularly, iron oxide nanoparticles (SPION) allow localization with magnetic resonance imaging and magnetic steering to the targeted tissue.
Methods: TAT-peptides were loaded on two different SPION: VSOP and Ferumoxytol. Coupling was reversible by electrostatic adsorption to the SPION. A fluorescence-tag allowed their detection in tissue and cell culture with fluorescence microscopy and their analysis in vitro.
To determine the loading capacity of the nanoparticles and their stability in water and under physiological circumstances (physiological buffer, serum) the hydrodynamic diameter, fluorescence quenching and relaxivity of the loaded nanoparticles in different suspensions were assessed. The stability of the nanoparticles in serum was analyzed using relaxivity and fluorescence measurements additionally to agarose gel electrophoresis. In cell culture tolerability and peptide release in vitro were assessed. A preliminary blood half-life of selected nanoparticles was determined spectrofluorometric using blood probes from dysferlin-deficient mice after i.v.administration. Additionally, the histological detection in the targeted tissue was evaluated.
Results: The results show that loading of SPION by electrostatic adsorption of small TATpeptides is possible. VSOP and Ferumoxytol could be loaded with 3 and 16 peptides respectively. Nanoparticle stability was strongly dependent on external factors (ionic strength, serum proteins). The adsorption remained reversible and TAT-peptides detached in biological suspensions. Loaded VSOP showed compared to Ferumoxytol a stronger peptide binding but were prone to aggregation in biological suspensions.
The measured blood half-life of SPION-peptide-particles was shorter than that of unloaded SPION. Histologically TAT-peptides could not be detected in the targeted tissue with fluorescence microscopy, but spectrofluorometric analysis of lysed muscle tissue allowed detection of a small amount of peptide.
Conclusion: Despite successful electrostatic loading of nanoparticles with TAT-peptides stability and controlled drug-release remain challenging. The blood-half-life and biodistribution of the nanoparticles pose additional challenges for the in vivo application of loaded SPION. Moreover, the physiological properties of the targeted tissue are crucial for successful drugdelivery.
