Neurosteroids (NS) are a special of group of endogenous steroids, which are synthesized in the central (CNS) or peripheral nervous system (PNS), which is not only a source but also a target for NS. As they are discussed as potential biomarkers for various cognitive disorders, research interest in this topic remarkably increases. In this context CSF becomes an interesting specimen for NS analysis, as it is the only accessible matrix which most likely reflects brain metabolism in living human beings. Analysis of NS is truly challenging for different reasons, such as low amounts of available matrix, ultra-trace-levels of expected steroids, and high structural similarity of endogenous steroids. Therefore, the aim of this work was the development of a comprehensive and sensitive method for profiling of an as large as possible set of NS in one aliquot of human CSF. For method development and evaluation, a set of fifty-one steroids, including (pro-)gestagens, androgens, corticoids, estrogens and steroid sulfates was selected, based on comprehensive literature research of neurosteroids already determined in human CSF and expanded with steroids covering major peripheral pathways of biosynthesis and metabolism. Profiling of endogenous steroids is well-established with gas chromatography (tandem) mass spectrometry (GC-MS(/MS)), (ultra) high performance liquid chromatography (tandem) mass spectrometry ((U)HPLC-MS(/MS)), or immunoassays (IA) – each method offering different advantages or disadvantages. As IA, HPLC and GC based methods were reported for ascending number of analytes that were detected, GC-MS was initially selected within this project regarding the selected large set of analytes. Analysis with GC-MS requires derivatization of analytes, therefore several well-established derivatization procedures were examined. Overall, none of the derivatization procedures provided acceptable results for further method development and analyte quantification, due to formation of multiple derivatives of some steroids and occurrence of coelution of side and main peaks of different endogenous steroids with same m/z. As alternative approach supercritical fluid chromatography (tandem) mass spectrometry (SFC-MS(/MS)) presents new and promising application opportunities and currently experiences a comeback to analytical science was therefore investigated for steroid profiling. Full method development included investigation of chromatographic and mass spectrometric parameters, followed by robustness testing. One of the unique features of SFC instrumentation is the opportunity to use a different make-up solution for ionization than mobile phase. Considering the rather poor ionization capacity of steroids, the different ion sources ESI, APCI, and APPI were tested for their suitability in combination with different make-ups. Finally, with its unique selectivity SFC-MS/MS was able and to overcome the derivatization issues of GC-MS and to distinguish between all selected steroids. Method development resulted in three optimized methods on different columns with ESI ionization that offer excellent separation in reasonable time and can be easily operated in one sequence as high-throughput approach. SFC-MS/MS further scores with facilitated sample preparation and reduced time expenses compared to GC-MS, as no time-consuming derivatization step and/or sulfate cleavage is required. In addition, the development of SFC-based methods also contributes to environmentally sustainable chemical research for the future. Altogether, considering the requirements of this project, the high potential of SFC-MS/MS in endogenous steroid profiling and its superiority towards GC-MS was demonstrated. In a subsequent project, the method will be validated with the CSF matrix. Prospectively, expansion of this method to other body fluids like blood seems also very promising. In the future, the SFC-ESI-MS/MS method will offer the opportunity to quantify a large set of NS within the rare specimen human CSF and may contribute to clarification of knowledge on metabolism and functions of NS.
Neurosteroide (NS) sind eine spezielle Gruppe endogener Steroide, die im zentralen (ZNS) oder peripheren Nervensystem (PNS) synthetisiert werden, welches nicht nur eine Quelle, sondern auch ein Target für NS ist. Das Forschungsinteresse an diesem Thema nimmt bemerkenswert zu, da NS als potenzielle Biomarker für verschiedene kognitive Störungen diskutiert werden. In diesem Zusammenhang wird Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) zu einem interessanten Material für die NS-Analyse, da sie die einzige zugängliche Matrix ist, welche am wahrscheinlichsten den Hirnstoffwechsel des lebenden Menschen widerspiegelt. Die Analyse von NS ist aus verschiedenen Gründen anspruchsvoll, wie z.B. durch geringe Mengen an verfügbarer Matrix, sehr niedrige Konzentrationen der erwarteten endogenen Steroide und deren hoher struktureller Ähnlichkeit. Ziel dieser Arbeit war es, eine umfassende und empfindliche Methode zur Detektion einer möglichst großen Menge von NS in einem Aliquot menschlicher CSF zu entwickeln. Für die Methodenentwicklung und -evaluierung wurden einundfünfzig Steroide, einschließlich (Pro-)Gestagenen, Androgenen, Kortikoiden, Östrogenen und Steroidsulfaten ausgewählt. Die Auswahl erfolgt basierend auf einer umfassenden Literaturrecherche zu bereits in CSF bestimmter NS und wurde um Steroide, welche wichtige Biosynthese- und Stoffwechselwege in der Peripherie abdecken, erweitert. Das Screening endogener Steroide mittels Gaschromatographie-(Tandem)- Massenspektrometrie (GC-MS(/MS)), (Ultra-) Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-(Tandem)-Massenspektrometrie ((U)HPLC-MS(/MS)) oder Immunoassays (IA) ist gut etabliert, wobei jede Methode unterschiedliche Vor- oder Nachteile bietet. Weil IA-, HPLC- und GC-basierte Methoden für eine aufsteigende Anzahl von zu detektierenden Analyten geeignet sind, wurde im Rahmen dieses Projekts zunächst GC-MS im Hinblick auf die ausgewählte große Anzahl von Analyten ausgewählt. Die Analyse mittels GC-MS erfordert eine Derivatisierung der Analyten. Daher wurden zahlreiche gut etablierte Derivatisierungsverfahren untersucht. Auf Grund der Bildung multipler Derivate einiger Steroide und des Auftretens von Koelution von Neben- und Hauptpeaks verschiedener endogener Steroide mit demselben m/z, lieferte insgesamt betrachtet keines der Derivatisierungsverfahren akzeptable Ergebnisse für die weitere Methodenentwicklung und Quantifizierung der Analyten. Als alternativer Ansatz erfährt die überkritische Flüssigkeitschromatographie-(Tandem)-Massenspektrometrie (SFC-MS(/MS)) derzeit ein Comeback in der analytischen Wissenschaft und bietet neue und vielversprechende Anwendungsmöglichkeiten und wurde daher für die Entwicklung einer Steroid-Screening-Methode eingehend untersucht. Die vollständige Methodenentwicklung umfasste die Untersuchung chromatographischer und massenspektrometrischer Parameter, gefolgt von Robustheitstests. Eines der einzigartigen Merkmale der SFC-Instrumentierung ist die Möglichkeit, eine von der mobilen Phase abweichende Make-up-Lösung für die Ionisierung zu verwenden. In Anbetracht der eher geringen Ionisierungseffizienz von Steroiden wurden die verschiedenen Ionenquellen ESI, APCI und APPI auf ihre Eignung in Kombination mit verschiedenen Make-up-Lösungen getestet. Die SFC-MS/MS war in der Lage die Derivatisierungsprobleme der GC-MS zu überwinden und mit ihrer einzigartigen Selektivität zwischen allen ausgewählten Steroiden zu unterscheiden. Die Methodenentwicklung führte zu drei optimierten Methoden auf verschiedenen Säulen mit ESI-Ionisation, die eine exzellente Trennung in angemessener Zeit bieten und als Hochdurchsatz-Ansatz leicht in einer Sequenz betrieben werden können. Die SFC-MS/MS punktet darüber hinaus mit einer vereinfachten Probenvorbereitung und einem geringeren Zeitaufwand im Vergleich zur GC-MS, da kein zeitaufwändige Derivatisierungsschritt und/oder Sulfatspaltung erforderlich ist. Darüber hinaus trägt die Entwicklung von SFC-basierten Methoden auch zu einer ökologisch nachhaltigen chemischen Forschung für die Zukunft bei. Insgesamt konnte unter Berücksichtigung der Anforderungen dieses Projektes das hohe Potential der SFC-MS/MS bei der Analyse endogener Steroide und ihre Überlegenheit gegenüber der GC-MS nachgewiesen werden. In einem sich dieser Arbeit anschließenden Projekt erfolgt die Validierung der Methode mit der Matrix CSF. Perspektivisch erscheint auch die Ausweitung dieser Methode auf andere Körperflüssigkeiten wie Blut sehr vielversprechend. In der Zukunft wird die SFC-ESI-MS/MS-Methode die Möglichkeit bieten, eine große Menge von NS innerhalb des menschlichen CSF zu bestimmen, und könnte somit zur weiteren Aufklärung des Wissens über Metabolismus und Funktionen von NS beitragen.
