Zusammenfassung Die chronische Nierentransplantatdysfunktion (CTD) ist eine Erkrankungen, die mit Beein- trächtigung der Gefäßintegrität einhergeht und durch das Immunsystem beeinflusst wird. Sie beinhaltet endotheliale Dysfunktion, Gewebehypoxie, sowie Störung der Gefäßregeneration und ist bis heute schwierig zu behandeln. Der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor A (VEGF) ist dabei ein wichtiger Regulator der vaskulären Homöostase. Funktionelle Autoan- tikörper gegen G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR), z. B. Angiotensin-II-Rezeptor Typ 1 (AT1R)-Antikörper und Endothelinrezeptor Typ A (ETAR)-Antikörper spielen bei einem Teil der Patienten mit CTD eine pathogenetische Rolle. Auch erhöhte Protease-aktivierter Rezeptor 1 (PAR-1)-Antikörpertiter konnten in den Seren von CTD-Patienten nachgewiesen werden. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von funktionellen Autoantikörpern gegen GPCR auf die VEGF-Sekretion von humanen kutanen mikrovaskulären Endothelzellen (HMEC-1), sowie die dabei beteiligten Signalwege, untersucht. Die HMEC-1 wurden mit isolierten Antikörpern von Patienten mit CTD und erhöhten AT1R- , ETAR- und PAR-1-Autoantikörpertitern (NTx-IgG) stimuliert. Sowohl die VEGF-Sekretion als auch die Sekretion des löslichen VEGF-Rezeptors (sFlt-1) wurden mittels Enzymim- munoassay aus dem Überstand und die entsprechende Boten Ribonukleinsäure (mRNA)- Regulation mittels quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion bestimmt. Zur Iden- tifikation des verantwortlichen GPCR dienten spezifische Inhibitoren. Die hierbei aktivier- ten intrazellulären Signalwege wurden mittels Promoter-Deletionsanalysen, Gel Shift Assay, Westernblot und spezifischer Genausschaltung durch kurze-interferierende-RNA untersucht. Die NTx-IgGs führten zu einer PAR-1-abhängigen Reduktion der VEGF-Freisetzung. Im Gegensatz dazu führte Thrombin, der endogene Aktivator von PAR-1, zu einer PAR-1- abhängigen Stimulation der VEGF-Freisetzung. Bei der Untersuchung der an der NTx-IgG- vermittelten und reduzierten VEGF-Freisetzung beteiligten, intrazellulären Signalwege konn- ten eine gesteigerte Expression des Transkriptionsfaktors cFos und eine erhöhte Produktion von sFlt-1 in den HMEC-1 identifiziert werden. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit erstmalig ein funktioneller Antikörper gegen den GPCR PAR-1 bei Patienten mit CTD identifiziert, der im Gegensatz zum natürlichen Li- ganden des PAR-1 die VEGF-Sekretion reduziert. Die Wirkung der NTx-IgGs wurde durch eine Hochregulation von cFos vermittelt. CFos scheint in HMEC-1 die VEGF-Freisetzung zu vermindern. Weiterhin führten die NTx-IgGs zu einer vermehrten Bildung von sFlt-1, was die VEGF-Verfügbarkeit zusätzlich reduzieren kann. In diesem Sinne könnten die Antikörper eine pathogenetische Rolle in der CTD spielen, indem sie durch eine Hemmung der VEGF- Freisetzung und -Verfügbarkeit, die endotheliale Dysfunktion und gestörte Gefäßintegrität unterhalten.
Abstract Patients with chronic kidney transplant dysfunction (CTD) show signs of disturbed vessel integrity and a strong autoimmune component. The disease is charactarised by endothelial dysfunction, tissue hypoxia and disturbed vessel regeneration and it is difficult to treat. Vas- cular endothelial growth factor (VEGF) is an important regulator of vascular homoeostasis. Functional autoantibodies against angiotensin II type 1 receptor (AT1R) and endothelin 1 type A receptor (ETAR) have been shown to aggravate CTD. Antibodies against the protease-activated receptor 1 (PAR-1) have been shown to exist in patients with CTD. In this thesis the influence of functional autoantibodies against G protein-coupled receptors (GPCR) on the VEGF secretion of human dermal micro vascular endothelial cells (HMEC-1) was investigated. A further objective was to describe the participating intracellular pathways. HMEC-1 were treated with IgGs isolated from patients with CTD that were positive for AT1R, ETAR and PAR-1 antibodies (NTx-IgG). VEGF and soluble VEGF receptor 1 (sFlt-1) secretion was measured with enzyme immunoassay. VEGF and sFlt-1 messenger ribonucleic acid (mRNA) regulation was measured with quantitative real-time polymerase chain reacti- on. The intracellular signaling pathways were investigated with promoter deletion analysis, gel shift assay, western blot and specific gene downregulation with short interfering RNA. NTx-IgG resulted in a PAR-1 dependent reduction of VEGF release. Thrombin, the intrinsic activator of PAR-1 resulted in a PAR-1 dependend increase of VEGF release. While investi- gating the intracellular signaling pathways we could identify an increased expression of cFos and an increased release of sFlt-1. In conclusion a new functional antibody against PAR-1 was identified which leads to a reduced VEGF production in HMEC-1. These effects are mediated by a strong up regulation of cFos. Furthermore a strong upregulation of sFlt-1 could be induced by the treatment with the antibodies. All this can lead to reduced availability of VEGF and thereby to disturbed vessel regeneration. This could mean that the antibodies play a role in the pathogenesis of CTD by promoting endothelial dysfunction and disturbed vessel integrity. But there is also evidence that the antibodies might prove protective.
