Algogens are chemically noxious substances produced by animals and plants for their protection against predators. Through behavioral tests on nine closely related African mole-rats (Bathyergidae), the naked mole-rat, the East African root rat and C57BL/6N mice, we identified novel insensitivities to three algogens: acid, capsaicin and mustard oil (allyl isothiocyanate, AITC). In parallel, we performed RNAseq on various tissues of these species including tissues of the nervous system, such as dorsal root ganglion (DRG) and spinal cord. This allowed us to investigate the algogen insensitivities by looking at differences in amino acid sequences and expression levels to identify key proteins of interest. We found that the Highveld mole-rat, unlike its closely related species, is behaviorally insensitive to AITC and weak acids and show impaired behavioral response to formalin. Multiple sequence alignments of the AITC receptor TRPA1, revealed three cysteine changes in the AITC binding site of several species of the mole-rat family. Calcium imaging experiments uncovered a decreased sensitivity for AITC activation through the channels exhibiting one of these amino acid changes. However, since four African mole-rat species have this mutation, an additional adaptation must have taken place in the Highveld mole-rat. RNAseq data identified nalcn as the only upregulated gene in the Highveld mole-rats compared to the other mole-rats. NALCN is a sodium leak channel important for establishing the resting membrane potential in neurons and we suggest that an upregulation of the channel protein makes nociceptors less likely to be excited by a noxious stimulus. To evaluate the contribution of NALCN to the observed AITC insensitivity in vivo, we looked at the nocifensive behavior towards AITC following an i.p. administration of Verapamil, an L-type calcium channel blocker known to block NALCN in vitro. Remarkably, the Highveld mole-rat responded to all algogens to which it had displayed insensitivity. Furthermore, we hypothesized that environmental challenges in the natural habitat of the species have led to an adaptation in the TRPA1 sequence and NALCN expression. Confirming this hypothesis, we identified roots in the burrows of the Highveld mole-rat containing TRPA1 activating substances as well as aggressive biting ants to which the Highveld mole-rat was impervious. Besides the naked mole-rat who is known to be behaviorally insensitive to acid and capsaicin, we also found two African mole-rats, the Natal mole-rat and Potwe mole-rat, that did not respond to capsaicin injection. Similar, to the naked mole-rat, we identified a functional TRPV1 channel in the Natal mole-rat. Therefore, further investigation is needed to dissect the molecular and evolutionary explanation of the insensitivity in these three species.
Algogene sind chemisch schädliche Substanzen, die von Tieren und Pflanzen zum Schutz gegen Räuber produziert werden. Durch Verhaltensuntersuchungen mit neun eng verwandten Sandgräbern (Bathyergidae), Nacktmullen, der Ostafrikanische Maulwurfsratte und C57BL/6N Mäusen haben wir neue Insensitivitäten für drei Algogene: Säure, Capsaicin und Senföl (Allylisothiocyanat, AITC) identifiziert. Gleichzeitig haben wir RNAseq von diversen Geweben dieser Arten durchgeführt, inklusive Geweben des peripheren Nervensystems wie den Hinterwurzelganglien (DRG) und dem Rückenmark. Hierdurch konnten wir die Algogen-Insensitivitäten untersuchen und Unterschiede in den Aminosäure-Sequenzen und Expressionsleveln von Proteinen identifizieren. Wir fanden heraus, dass der Highveld-Graumull, im Unterschied zu ihm eng verwandten Arten, verhaltensunempfindlich gegenüber AITC sowie schwachen Säuren war und und eine gestörte Verhaltensreaktion auf Formalin zeigte. Mehrfache Sequenz-Angleichungen des AITC-Rezeptors TRPA1 enthüllten drei Cystein-Änderungen in der AITC-Bindungsstelle in mehreren Spezies der Graumull-Familie. Kalzium-Imaging Experimente enthüllten eine herabgesetzte Sensitivität der Kanäle mit einer dieser drei Aminosäuren-Änderung für die Aktivierung durch AITC. Da diese Mutation jedoch in vier Arten der Graumull-Familie vorkommt, muss ein zusätzlicher Adaptationsprozess bei den Highveld-Graumullen stattgefunden haben. RNAseq-Daten identifizierten Nalcn als das einzige hochregulierte Gen der Highveld-Graumulle im Vergleich zu den anderen Mullen. NALCN ist ein Natrium Leck-Kanal, der wichtig ist, um das Ruhemembranpotenzial in Neuronen herzustellen, und wir folgern, dass eine Hochregulierung des Kanalproteins die Wahrscheinlichkeit verringert, mit der Nozizeptoren von einem schädlichen Reiz angeregt werden können. Um den Beitrag von NALCN zur beobachteten AITC-Insensitivität in vivo zu ergründen, untersuchten wir das nocifensive Verhalten gegenüber AITC nach einer i.p. Verabreichung von Verapamil, einem L-Typ-Calciumkanalblocker, der bekanntermaßen NALCN in vitro blockiert. Bemerkenswerterweise reagierte der Highveld-Graumull danach auf alle Algogene, auf die er vorher Insensitivitäten gezeigt hatte. Zusätzlich vermuteten wir, dass Herausforderungen im natürlichen Lebensraum der Art zu einer Anpassung der TRPA1-Sequenz und der NALCN-Expression geführt haben. Diese Hypothese bestätigend, identifizierten wir Wurzeln in den Bauen der Highveld-Graumulle, die TRPA1-aktivierende Substanzen sowie aggressiv beißende Ameisen enthielten, denen gegenüber die Highveld-Graumulle unempfindlich waren. Neben dem Nacktmull, welcher bekanntlich verhaltensunempfindlich gegenüber Säure und Capsaicin ist, fanden wir zwei weitere Sandgräber: den Natal-Graumull und den Potwe-Mull, die nicht auf Capsaicin-Injektionen reagierten. Wie beim Nacktmull identifizierten wir einen funktionellen TRPV1-Kanal im Natal-Graumull. Dies macht weitere Untersuchungen erforderlich, um die molekularen und evolutionären Mechanismen der Insensitivität bei diesen drei Arten zu ergründen.
