Light-based methodologies enjoy popularity due to their non-invasive nature. In particular in the field of optogenetics, where genetic targeting of neurons permits not only simultaneous imaging of a large number of cells but also optical control of neuronal activity. For this, ion channels or pumps are inserted into the membrane which are activated by light. A deep biophysical understanding of the optogenetic systems is key for their successful application.
In this thesis, I present a new member in the family of organic voltage sensors. I demonstrate that in a single lipid bilayer environment, the carotenoid Zeaxanthin has a linear and reversible spectral Raman response to an electric field applied across the membrane. The underlying mechanism is an increased photoisomerization rate resulting in a higher 13-cis population which is detected via a characteristic vibrational band at 1130 cm−1.
Channelrhodopsin-2 (ChR2) is a frequently used protein in optogenetics to silence neuronal activity. By variation of amino acid side chains, we found experimental evidence for ground-state heterogeneity in the hydrogen bond interactions of the retinal protonated Schiff base (PSB). We have identified with Raman spectroscopy two spectral components of the C=N–H mode of the PSB at 1661 and 1665 cm−1, representing hydrogen bonds to different amino acid side chains. These two interactions of the PSB could be essential for a voltage-sensing mechanism in ChR2.
In a pioneering approach we combined time-resolved absorption spectroscopy with serial femtosecond X-ray crystallography to scrutinize mechanistic details of sodium pumping in Krokinobacter eikastus rhodopsin 2 (KR2). Using an infrared-emitting quantum cascade laser (QCL), we verified that crystalline KR2 exhibits reaction kinetics similar to those observed in its detergent solubilized form. Hereupon, we have identified a previously proposed transient sodium binding site during the O intermediate where the sodium is coordinated by the amino acid side chains of N112 and D251. The findings regarding the ion transport mechanism in KR2 will facilitate the design of protein variants for an optogenetic application.
Bistable G-protein coupled receptors (GPCRs) have two thermally stable conformations and are a promising class of rhodopsins which have the potential to serve as an optogenetic switch. We were able to conduct a first biophysical characterization of the invertebrate jumping spider rhodopsin-1 (JSR1). We propose a model of the two-photon reaction based on spectroscopic results. During these reactions, the Schiff base stays protonated implying that a deprotonation is not a prerequisite for the function of bistable GPCRs. A proposed mediating water molecule as part of the counterion complex in the inactive conformation is identified by Raman spectroscopy and later confirmed by an X-ray crystallographic structure.
In conclusion, this thesis provides insights into the mechanistic details of established and upcoming optogenetic tools. These results will help to adapt their biophysical properties better suiting the needs of application.
Lichtbasierende Methoden erfreuen sich aufgrund ihrer nicht-invasiven Eigenschaft großer Beliebtheit. Im Besonderen in der Optogenetik, wo Neuronen genetisch modifiziert werden um nicht nur die simultane Beobachtung einer großen Anzahl von Neuronen, sondern auch optische Kontrolle von neuronaler Aktivität zu ermöglichen. Hierzu werden Ionenkanäle oder -pumpen in die Membran gebracht, die durch Licht aktiviert werden können. Ein tiefes Verständnis von optogenetischen Systemen ist eine Schlüsselvoraussetzung für eine erfolgreiche Anwendung.
In dieser Arbeit präsentiere ich einen Neuzugang in die Familie der organischen Spannungssensoren. Ich demonstriere, dass das Karotenoid Zeaxanthin, eingebracht in eine einzelne Lipiddoppelschicht, eine lineare und reversible Reaktion zeigt, wenn ein elektrisches Feld über die Membran angelegt wird. Der zugrunde liegende Mechanismus ist eine größere Population an 13-cis Isomeren, hervorgerufen durch eine erhöhte Photoisomerationsrate. Dies führt zu einem Anwachsen einer charakteristischen Vibrationsbande bei 1130 cm−1.
Kanalrhodopsin-2 (ChR2) wird regelmäßig in der Optogentik genutzt um neuronale Aktivität zu verhindern. Durch Variation von Aminosäurenseitenketten liefern wir Beweise für eine Heterogenität in der Wasserstoffbrückeninteraktion der protonierten Schiffschen Base (PSB) im Grundzustand. Wir konnten mit Raman Spektroskopie zwei spektrale Komponenten in der PSB Vibrationsmode (C=N–H) bei 1661 und 1665 cm−1 identifizieren, die jeweils eine Wasserstoffbrücke zu einer anderen Aminosäurenseitenkette darstellen. Diese zwei Interaktionen könnten von Bedeutung für einen Spannungsmessungsmechanismus in ChR2 sein.
Um den Natriumpumpmechanismus von Krokinobacter eikastus rhodopsin 2 (KR2) zu untersuchen, haben wir in einer Pionierarbeit zeitaufgelöste Absorbtionspektroskopie mit Röntgenkristallographie kombiniert. Die Benutzung eines Quantumkaskadenlasers (QCL) ermöglichte es uns sicher zu stellen, dass kristallines KR2 vergleichbare Reaktionskinetiken aufweist als in Detergens gelost. Wir konnten daraufhin eine im Vorfeld postulierte vorübergehende Natriumbindungsstelle während des O Intermediats zwischen den Seitenketten von N112 und D251 identifizieren. Die Ergebnisse über den Ionentransportmechanismus werden die Konzipierung von Proteinvarianten für eine optogenetische Anwendung erleichtern.
Bistabile G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) haben zwei thermisch stabile Konformationen und sind eine vielversprechende Klasse von Rhodopsinen für einen optogentischen Schalter. Wir konnten eine erste biophysikalische Charakterisierung von jumping spider rhodopsin-1 (JSR1) durchführen. Wir schlagen, basierend auf spektroskopischen Ergebnissen, ein Model einer zwei-Photonen Reaktion vor. Während dieser Reaktionen bleibt die SB protoniert. Dies impliziert, dass eine Deprotonierung keine Voraussetzung für die Funktion von bistabilen GPCRs ist. Ein angenommenes Wassermolekül als Teil des Konterionennetzwerks konnte mit Raman Spektroskopie detektiert werden, was später durch eine Röntgenstruktur bestätigt wurde.
Zusammenfassend bietet diese Arbeit Einblicke in die Mechanismen von etablierten sowie neuen optogenetischen Werkzeugen. Die Resultate werden dazu beitragen, ihre biophysikalischen Eigenschaften an die Erfordernisse der Anwendung anzupassen.
