Das Phytohormon Cytokinin spielt bei nahezu allen pflanzlichen Entwicklungsprozessen und der Reaktion auf biotischen und abiotischen Stress eine bedeutende Rolle. Die Konzentration des Hormons wird zeitlich und lokal präzise kontrolliert, unter anderem durch deren Degradation durch CKX-Enzyme. Einige Mechanismen, durch welche die Expression und die Aktivität der CKX-Enzyme reguliert werden, wurden bereits detailliert untersucht. Eine mögliche Regulation durch NATs wurde jedoch bislang nicht analysiert. NATs bieten durch ihre einzigartigen Eigenschaften eine exzellente Möglichkeit, die Expression ihrer Sense-Partner zu modulieren. Einerseits können sie mittels komplementärer Basenpaarung oder spezifischen Sekundärstrukturen gezielt mit DNA, RNA und Proteinen interagieren, andererseits kann ihre Aktivität durch die Regulation ihrer Transkription oder subzellulären Lokalisation schnell und flexibel kontrolliert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Existenz von NATs an den Loci von CKX-Genen analysiert und identifizierte CKX-NATs wurden strukturell sowie funktionell charakterisiert. Durch eine in silico-Analyse wurden Hinweise auf die Existenz von NATs an nahezu allen CKX-Loci der Modellpflanze A. thaliana gefunden. An den Loci der Gene CKX1, CKX5 und CKX6 konnte das Vorkommen von NATs experimentell bestätigt werden. Eine RACE-Analyse zeigte, dass die NATs dieser Loci diverse verschiedene Isoformen mit variablen Exon-Intron-Strukturen sowie heterogenen Transkriptstarts und -enden aufweisen. Die identifizierten CKX-NATs besitzen eine 5‘-Cap sowie einen Poly-A-Schwanz, was auf eine aktive Transkription durch die RNA-Polymerase II hinweist. Die CKX1-NATs und CKX6-NATs kodieren wahrscheinlich nicht für Proteine. Für CKX5-NAT existieren mehrere nicht-kodierende Isoformen und eine Isoform, welche die CDS des UBC16-Gens enthält. Expressionsanalysen wiesen auf eine Co-Regulation von CKX-NATs mit ihren jeweiligen Sense-Transkripten hin, was eine positive Regulation der CKXs durch die CKX-NATs vermuten lässt. Mithilfe von T-DNA-Insertionsmutanten, in denen das CKX5-NAT-Level reduziert ist, konnte für CKX5-NAT ein positiv regulatorischer Einfluss auf das CKX5-Transkriptlevel bestätigt werden. Die Erhöhung der CKX1-Transkriptlevel in CKX1-NAT-Überexpressionslinien weist ebenso auf eine positive Regulation von CKX1 durch CKX1-NAT hin. Die experimentelle Analyse der subzellulären Lokalisation der CKX-NATs lässt vermuten, dass der größte Teil der Transkripte im Cytoplasma lokalisiert ist. Zusammen mit der positiven Regulation der Sense-Partner, lassen sich die möglichen Wirkungsweisen der CKX-NATs eingrenzen. Eine naheliegende Hypothese wäre, dass die CKX-NATs die Stabilität der entsprechenden CKX-Transkripte im Cytoplasma positiv beeinflussen, möglicherweise durch die Maskierung der Bindestellen von miRNAs oder RNA-degradierenden Enzymen. Um mögliche Prozesse aufzudecken, die von den CKX-NATs beeinflusst werden, wurden einerseits die Expressionsdomänen der CKX-NATs und andererseits deren Transkriptleveländerung durch externe Stimuli untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass zum einen die Promotoren von CKX1-NAT und CKX6-NAT in reifen Pollen aktiv sind und dass zum anderen die Transkriptlevel durch das Phytohormon Auxin induziert werden. Diese Beobachtungen deuten auf eine Bedeutung von CKX1-NAT und CKX6-NAT für die Entwicklung oder Funktion der Pollen hin, möglicherweise durch die pollenspezifische Modulation der CKX1- bzw. CKX6-Level in Reaktion auf Auxin. Der CKX6-NAT-Promotor ist zudem im Embryosack und in den Stomata aktiv, was auf einen Einfluss von CKX6-NAT auf die Funktion in diesen Strukturen hinweisen könnte. Ähnlich dem CKX5-Transkriptlevel stieg das CKX5-NAT-Level durch Behandlung mit exogenem Cytokinin schnell an, wohingegen es in Pflanzen mit reduziertem Cytokininstatus verringert war. Diese Ergebnisse legen nahe, dass CKX5-NAT in einen negativen Rückkopplungsmechanismus involviert ist, um das CKX5-Level bei hohen Cytokininkonzentrationen zu steigern. Die CKX5-NAT-Promotoraktivität in der Wurzelspitze und im Sprossapex könnte auf eine Rolle von CKX5-NAT bei der Entwicklung von RAM und SAM hinweisen. Schließlich wurde die evolutionäre Konservierung der CKX-NATs untersucht. Die Analysen zeigten, dass an nahezu allen orthologen Genloci von CKX1 und CKX6 verschiedener Spezies der Angiospermen NATs existieren, von denen die meisten vermutlich nicht für Proteine kodieren. An allen der untersuchten, orthologen Genloci von CKX5 in Dikotyledonen wurden proteinkodierende tail-to-tail-NATs identifiziert, an einigen der Loci existieren jedoch auch nicht-kodierende Isoformen. Die Nukleotidsequenzen und Spleißgrenzen von CKX1-NAT- und CKX6-NAT-Orthologen sind evolutionär konserviert, was eine funktionelle Bedeutung dieser lncNATs innerhalb der Angiospermen vermuten lässt. Zusammengenommen weisen die Ergebnisse dieser Abeit auf eine biologische Relevanz der CKX-NATs hin, die Transkriptlevel der entsprechenden CKXs zu kontrollieren.
The plant hormone cytokinin is involved in the regulation of nearly all developmental processes and responses to biotic and abiotic stresses. Cytokinin concentrations are precisely controlled by different mechanisms, such as the degradation through CKX enzymes. Some of the mechanisms by which the expression and activity of CKX enzymes are regulated have already been reported. However, a possible control of CKX through NATs has not been analyzed yet. The unique properties of NATs make them excellent regulators of the expression of their sense partners. On the one hand, NATs can interact specifically with DNA, RNA and proteins via complementary base pairing and specific secondary structures. On the other hand, the activity of NATs can be quickly and flexibly regulated by altering their transcription and subcellular localization. In this work, the existence of NATs at CKX gene loci was analyzed and the identified CKX-NATs were structurally and functionally characterized. An in silico analysis indicated NATs at almost all CKX loci of the model plant A. thaliana and the existence of NATs could be experimentally proven at the gene loci of CKX1, CKX5 and CKX6. Via RACE analysis different isoforms with various exon-intron-structures as well as heterogenous transcription start and termination sites could be identified. CKX-NATs are 5’-capped and polyadenylated suggesting that they are transcribed by RNA polymerase II. Presumably, CKX1-NATs and CKX6-NATs and most CKX5-NAT isoforms do not encode for functional proteins while one of the identified CKX5-NAT isoforms comprises UBC16-coding gene. Transcript level analyses in different tissues and in response to various external stimuli indicated a co-regulation of CKX-NATs and their cognate CKXs, suggesting a positive regulation of CKXs through CKX-NATs. The analysis of CKX5-NAT T-DNA insertion lines confirmed the positive effect of CKX5-NAT on CKX5. Similarly, in CKX1-NAT overexpressing plants, CKX1 levels were increased, implying a positive regulatory mode of interaction. Analyses of the subcellular localization of CKX-NATs indicated that most of their transcripts localize to the cytoplasm. Taking together these results, it can be hypothesized that CKX-NATs stabilize their cognate CKX transcripts within the cytoplasm, possibly through masking target sites for miRNAs or RNA-degrading enzymes. To uncover possible processes which are regulated through CKX-NATs, their expression patterns and transcriptional responses to exogenous stimuli were studied. Promotors of CKX1-NAT and CKX6-NAT were active in mature pollen and their transcript levels were induced by the phytohormone auxin. These observations point to a role of CKX1-NAT and CKX6-NAT in pollen function, possibly via pollen-specific modulation of CKX1 and CKX6 levels in response to auxin. In addition, the CKX6-NAT promoter was active within the embryo sac and stomatal guard cells, hinting to a function of CKX6-NAT in these structures. Similar to CKX5, CKX5-NAT transcript levels were rapidly induced by exogenous cytokinin and decreased in mutant plants with reduced endogenous cytokinin status. Thus, CKX5-NAT might be involved in a negative feedback-loop, increasing the CKX5 transcript levels in response to high cytokinin levels. Moreover, the CKX5-NAT promotor is active in the root and shoot apices, suggesting a possible function for the development of the RAM and SAM. Finally, the evolutionary conservation of CKX-NATs was analyzed. At almost all orthologous CKX1 and CKX6 loci in different angiosperm species, NATs were identified as probably non-coding transcripts. At nearly all orthologous CKX5 loci of dicots, protein-coding tail-to-tail NATs were identified and, at some of the loci, also non-coding isoforms exist. Nucleotide sequences and splice junctions of CKX1-NAT and CKX6-NAT orthologues are evolutionary conserved, hinting to a functional role of CKX1-NATs and CKX6-NATs in angiosperms. Taken together, the results provide evidences that CKX-NATs are biologically relevant to control the respective CKX transcript levels in plants.
