Mitochondriopathies are diseases that are based on disorders of mitochondrial energy production. The clinical phenotype is heterogeneous. They usually occur as multi-organ diseases; mainly organs with high energy requirements are affected. Mitochondrial diseases are genetic diseases and can be inherited either mitochondrially or nucleus encoded. This study was based on the characterisation of compound heterozygous mutations of the gene NDUFB3 (missense- and nonsense-mutation in exon 2 and 3) in the mitochondrial respiratory chain complex I from a patient born in 2008. The prematurely born infant showed recurrent acidosis from birth. In the course of development the baby showed a bilateral auditory defect and a growth retardation. A muscle biopsy identified reduced enzyme activity of the complex I and therefore, a mitochondrial dysfunction was ascertained. Via exome sequencing, two variants in the gene NDUFB3 were identified whose pathogenicity had not yet been known. To verify the findings cell rescue experiments (lentiviral transduction) were performed in order to determine whether the two mutations were responsible for the complex I deficiency. In order to restore normal complex I respiratory activity, wild type cDNS was expressed into the defective fibroblast cell line. In addition, lentiviral mediated expression of the isolated missense- and nonsense-mutations was performed and the complex I activity of the non-transduced and transduced cells were measured. Furthermore the expression of selected proteins from complex I and III were analysed with Western blot to obtain evidence of the role of the NDUFB3-protein during the assembly process within the respiratory chain. The respiratory function of complex I found in naive cells of the patient measured 19 % while the proteins NDUFB3 and NDUFS3 were absent. The expression of wild type genotype of NDUFB3 reconstituted the complex I activity to an almost normal level and both previously mentioned proteins were again verifiable. The complexI protein NDUFB8 was weakly expressed in patient fibroblasts, but it’s presence also increased 5 after transduction. After the control NHDFneo had received all transgenes, there was no benefit detectable. Taking everything into account the detected mutations in the gene NDUFB3 cause a strong reduction of complex I activity and are considered to be the cause of the severe clinical symptoms of the patient. Therefore, the gene NDUFB3 can be included as a new candidate gene for the genetic evaluation of patients with complex I defect.
Mitochondriopathien sind Erkrankungen, die auf Störungen der Energiegewinnung der Mitochondrien beruhen. Der klinische Phänotyp ist heterogen. Sie treten meist als Multiorganerkrankungen auf, wobei hauptsächlich Organe mit hohem Energiebedarf betroffen sind. Mitochondriopathien sind genetische Erkrankungen und können entweder mitochondrial oder kernkodiert vererbt werden. Aufgabe dieser Arbeit war die Charakterisierung compound heterozygoter Mutationen im Gen NDUFB3 (missense- und nonsense-Mutation in Exon 2 bzw. 3) des mitochondrialen Atmungskettenkomplexes I einer 2008 geborenen Patientin. Das Frühgeborene zeigte von Geburt an rezidivierende Laktatazidosen und wies eine Muskelhypotonie auf. Im Verlauf zeigte sich eine bilaterale Hörstörung, eine motorische Entwicklungsverzögerung und eine geistige Retardierung. Im Muskelgewebe wurde eine reduzierte Enzymaktivität des Atmungskettenkomplexes I gemessen und die Diagnose einer Mitochondriopathie gestellt. Durch Exom- Sequenzierung wurden zwei seltene Varianten im Gen NDUFB3 identifiziert, deren Pathogenität noch nicht bekannt war. Nach Bestätigung der beiden NDUFB3-Varianten mittels Sequenzierung von Fibroblasten-DNA erfolgten Zell-Rescue-Experimente (lentivirale Transduktion) zur Überprüfung, ob die beiden Mutationen ursächlich für den Komplex I-Defekt sind. Durch Einschleusen einer NDUFB3-cDNA Expressionskassette (Wildtyp-Genotyp) in die Fibroblastenzelllinie der Patientin wurde versucht, die deutlich erniedrigte Komplex I Enzymaktivität wiederherzustellen. Zusätzlich wurden auch die beiden Allele mit der missense- bzw. nonsense-Mutation in die Patientenfibroblasten und eine Wildtyp- Kontrollzelllinie eingeschleust und die Enzymaktivität des Komplexes I der nicht transduzierten und aller transduzierten Zellen gemessen. Die Menge bestimmter Proteine des Komplexes I und III wurde mittels Western Blot quantifiziert, um die Auswirkung der Mutationen auf Proteinniveau zu untersuchen und mögliche Hinweise auf die Rolle des NDUFB3-Proteins während der Assemblierung zu erhalten. In den nicht transduzierten Fibroblasten der Patientin betrug die Komplex IEnzymaktivität nur 19 % im Vergleich zur Wildtypkontrolle. Die Komplex I-Proteine NDUFB3 und NDUFS3 waren in den Fibroblasten der Patientin nicht nachweisbar, NDUFB8 zeigte lediglich eine sehr schwache Bande im Western Blot. Das Einschleusen des Wildtyp-Allels rekonstituierte die Enzymaktivität des Komplexes I und die Menge aller untersuchter Proteine nahezu auf Normalniveau. Die Transduktion der Allele in die Kontrollzelllinie ergab durch die alleinige Überexpression keine gesteigerte Komplex I-Enzymaktivität. Diese Ergebnisse zeigen, dass die in dieser Arbeit validierten compound heterozygoten Mutationen im Gen NDUFB3 eine starke Reduktion der Komplex I-Enzymaktivität verursachen. Sie führen zudem zu einer Störung der Assemblierung des Komplexes I und sind als ursächlich für die schweren klinischen Symptome der Patientin anzusehen. Daher kann das Gen NDUFB3 als neues Kandidatengen für die genetische Abklärung von Patienten mit Komplex I-Defekt in die Paneluntersuchung mit aufgenommen werden.
