In this protocol we describe the incorporation of bio-orthogonal amino acids as a versatile method for visualizing and identifying de novo–synthesized proteins in the roundworm Caenorhabditis elegans. This protocol contains directions on implementing three complementary types of analysis: ‘click chemistry’ followed by western blotting, click chemistry followed by immunofluorescence, and isobaric tags for relative and absolute quantification (iTRAQ) quantitative mass spectrometry. The detailed instructions provided herein enable researchers to investigate the de novo proteome, an analysis that is complicated by the fact that protein molecules are chemically identical to each other, regardless of the timing of their synthesis. Our protocol circumvents this limitation by identifying de novo–synthesized proteins via the incorporation of the chemically modifiable azidohomoalanine instead of the natural amino acid methionine in the nascent protein, followed by facilitating the visualization of the resulting labeled proteins in situ. It will therefore be an ideal tool for studying de novo protein synthesis in physiological and pathological processes including learning and memory. The protocol requires 10 d for worm growth, liquid culture and synchronization; 1–2 d for bio-orthogonal labeling; and, with regard to analysis, 3–4 d for western blotting, 5–6 d for immunofluorescence or ~3 weeks for mass spectrometry. This abstract is reproduced with the permission of Nature Publishing Group. It is part of the following publication: Ullrich M, Liang V, Chew YL, Banister S, Song X, Zaw T, Lam H, Berber S, Kassiou M, Nicholas HR, Gotz J. Bio-orthogonal labeling as a tool to visualize and identify newly synthesized proteins in Caenorhabditis elegans. Nat Protoc, 2014. 9(9): p. 2237-55.
In diesem Versuchsprotokoll beschreiben wir die Inkorporation von bio- orthogonalen Aminosäuren als eine vielfältig anwendbare Methode um neu synthetisierte Proteine im Rundwurm Caenorhabditis elegans zu visualisieren und identifizieren. Unsere Methode ermöglicht die Analyse des de novo Proteoms mittels drei verschiedener, sich ergänzender Verfahren: Click Chemistry, gefolgt von Western Blotting, Immunfluoreszenz oder quantitativer Massenspektrometrie durch isobare Markierung für relative und absolute Quantifizierung (iTRAQ). Die Analyse des de novo Proteoms war bislang nur in begrenztem Umfang möglich, weil die chemischen Eigenschaften von Proteinen unabhängig vom Zeitpunkt ihrer Synthese sind. Unser Protokoll umgeht dieses Hindernis, indem es die Aufnahme von chemisch modifiziertem Azidohomoalanin anstelle der natürlichen Aminosäure Methionin in neu entstehende Proteine ermöglicht. So kann das markierte de novo Proteom identifiziert und in situ visualisiert werden. Die Methode ist daher ein äußerst geeignetes Instrument um die de novo Proteinbiosynthese in physiologischen und pathologischen Prozessen, wie etwa Lernen und Gedächtnisbildung, zu untersuchen. Es werden 10 Tage für die Anzucht und Synchronisation der Würmer in flüssigem Medium benötigt; 1-2 Tage für die bio-orthogonale Markierung; sowie 3-4 Tage für die Analyse mittels Western Blotting, bzw. 5-6 Tage für Immunfluoreszenz oder ~3 Wochen für Massenspektrometrie.
