Indirect labelling techniques of biomolecules with primary and secondary antibodies for immunofluorescence-based imaging is still serving well the needs of biologists in advancing the understanding of biological processes. However, these techniques impose a stringent selection of primary and secondary antibody pairs to avoid false-positive cross-labelling leading to misinterpretation, in particular for (co-)localization / interaction of target molecules. Due to this, indirect immunofluorescence is either regularly limited to two - four antigens or a particular combination of target molecule labelling can’t be carried out at all. This work presents a novel immunolabelling method to use this ostensible disadvantage of cross-labelling secondary antibodies for separation of their fluorescence signals from single labelled structures by use of multi-dimensional fluorescence detection. This becomes possible since the undesirable cross-labelling among secondary antibodies leads to the generation of new characteristic Förster resonance energy transfer (FRET) emission spectra as well as change in fluorophores lifetime properties. To demonstrate this, a sequential antibody labelling protocol was adapted and appropriate fluorophore pairs were selected on interacting secondary antibodies achieving FRET effects. A spectrally resolved fluorescence lifetime imaging (sFLIM) system and multi-wavelength pulse interleaved excitation were combined together for multi-dimensional signal detection. The short dead time of the time-correlated single photon counting electronics allows for rapid-sFLIM measurements enabling data acquisition at very high detection throughput. For data analysis, a pattern-matching based linear-unmixing technique was employed for efficient identification and unmixing of multi-labelled samples using reference emission spectra and fluorescence decay patterns from each immunolabelled biomolecule. Additionally, separation of up to three immunolabelled proteins from strong autofluorescence components in human lung tissue sections by sFLIM detection and applying appropriate autofluorescence reference patterns in unmixing analysis was demonstrated. The spectral-FLIM(-FRET) detection system together with pattern-matching analysis forms an excellent tool for use in indirect immunofluorescence by overcoming the undesirable effect of secondary antibody cross-labelling by assigning separate colour channels to cross-labelled antigens or proteins. Altogether, this work demonstrates that spectral-FLIM could greatly enhance sensing and unmixing capabilities for native autofluorescence and/or external fluorescent markers in biomedical as well as clinical research.
Im Bereich der Immunfluoreszenz-basierten Bildgebung sind indirekte Markierungs-techniken von Biomolekülen mit primären oder sekundären Antikörpern von großem Wert, um das Verständnis biologischer Prozesse zu vertiefen. Um falsch-positive Kreuzreaktionen zu vermeiden, gelten jedoch stringente Auswahlkriterien an Primär- und Sekundärantikörperpaare. Solche Kreuzreaktionen können zu Fehlinterpretationen führen, insbesondere in den Bereichen (Co-) Lokalisierung und Wechselwirkung der Zielmoleküle. Dies hat wiederum zur Folge, dass indirekte Immunofluoreszenz häufig auf zwei-vier Antigene beschränkt ist oder dass bestimmte Markierungskombinationen gar nicht möglich sind. In dieser Dissertation wird eine neuartige Methode zur Immunmarkierung vorgestellt, welche die offensichtlichen Nachteile der Kreuzreaktion von sekundären Antikörpern ausnutzt, um die Fluoreszenzsignale einfach markierter Strukturen mittels multidimensionaler Fluoreszenzdetektion zu unterscheiden. Die Methode basiert darauf, dass die unerwünschte Kreuzreaktion zwischen sekundären Antikörpern sowohl zum Auftreten neuer, spezifischer Fluoreszenzenergietransfers-Emissionsspektren (FRET) als auch zu Veränderungen in den Fluoreszenzlebensdauern der Fluorophore führt. Um dies zu demonstrieren, haben wir ein sequentielles Antikörpermarkierungsprotokoll entworfen und entsprechende Fluorophorpaare für interagierende sekundäre Antikörper identifiziert, unter welchen FRET möglich ist. Für die Detektion wurde ein spektral- und zeitauflösendes Fluoreszenzlebensdauersystem (sFLIM) genutzt, welches über ein verschachtelt-gepulstes Anregungsystem mit multiplen Wellenlängen sowie über ein multidimensionales Detektionssystem verfügt. Dank der kurzen Totzeit der eingesetzten Elektronik für die zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung können sogenannte rapid-sFLIM Messungen mit sehr hohem Detektionsdatendurchsatz durchgeführt werden. In der Datenanalyse wurde eine Technik zum Musterabgleich angewandt, die eine effiziente Identifikation und Entmischung von mehrfach markierten Proben mittels Referenzemissionsspektren sowie Fluoreszenzabklingmustern der jeweiligen immun-markierten Biomoleküle erlaubt. Zusätzlich demonstriert die Arbeit die Abtrennung der Fluoreszenzsignale von bis zu vier immun-markierten Proteinen sowie der Hintergrundautofluoreszenz von menschlichem Lungengewebe mittels sFLIM Detektion durch Anwendung passender Referenzmuster im Entmischungs- und Analyseschritt. Die Kombination eines spektralen FLIM-(FRET) Detektionssystems mit einer Musterabgleichsanalyse erweist sich als ein sehr nützliches Werkzeug für indirekte Immunofluoreszenz Untersuchungen. Sie überwindet die unerwünschten Nebeneffekte der Kreuzreaktion von sekundären Antikörpern indem sie kreuzreagierende Antigene oder Proteinen jeweils in einen separaten Farbkanal zuweist. Insgesamt wird in dieser Arbeit aufgezeigt, dass die simultane Detektion von Fluoreszenzabklingzeiten und Charakteristika von Emissionspektren mittels spektral-FLIM, die Empfindlichkeit und Separierung der einzelnen Komponenten signifikant verbessern kann. Dies gilt sowohl für native Autofluoreszenz wie auch für externe Fluoreszenzmarker in der biomedizinischen oder klinischen Forschung.
