Hintergrund: menschliches Wachstumshormon (hGH) enthält zwei Disulfidbrücken, die auch in anderen Spezies und in Prolaktin vorliegen. Es ist bekannt, dass hGH mit reduzierten und alkylierten Cysteinen, dadurch frei von Disulfidbrücken, fast die gleiche Bioaktivität wie Wildtyp hGH in Tiermodellen hat. Für diese Arbeit identifizierten wir Patienten mit angeborenem Wachstumshormonmangel und Mutationen der Cysteine im Wachstumshormonmolekül. Dann führten wir verschiedene Untersuchungen durch, um den jeweils zugrundeliegenden Mechanismus des Wachstumshormonmangels festzustellen. Zusätzlich untersuchten wir die Eigenschaften von Wachstumshormon ohne die Disulfidbrücken, ohne diese chemisch zu zerstören. Methoden: Plasmide mit hGH-cDNA, die der cDNA der betroffenen Individuen entspricht wurden mittels site-directed mutagenesis erzeugt. Um hGH frei von Cysteinen zu erzeugen ersetzten wir alle Cystein-codierenden Tripletts mit Alanin-codierenden Tripletts. Das mutierte Wachstumshormon wurde dann in Hypophysenzelllinien (AtT-20 und GC) exprimiert und analysiert mit Immunohistologie, Immunoassays und Western-Blots. hGH und hGH-Varianten exprimiert in CHO-K1 und HEK Zellen wurden aufgereinigt und die Bioaktivität in Zellproliferationsassays mit stabil mit dem Wachstumshormonrezeptor transfizierten Baf/B03 und einen trunkierten Prolaktinrezeptor exprimierenden Nb2 Zellen bestimmt. Rezeptorbindung der Mutanten wurde in Kompetitionsassays mit GHBP (growth-hormone binding protein) untersucht. Um die Stabilität der Mutanten zu untersuchen wurde die Resistenz gegen Trypsinverdau untersucht. Ergebnisse: Unsere umfangreiche Analyse identifizierte eine Vielzahl von Mechanismen, welche den Funktionsverlust durch die Cysteinmutationen bedingen. Manche hGH-Mutationen zeigten eine stark reduzierte Expression und Sekretion in Hypophysenzellen, andere hatten eine signifikant reduzierte Affinität zu dem Wachstumshormonrezeptor und eine reduzierte Bioaktivität. Bemerkenswerterweise bildet die hGH-C53S Variante disulfid-verbundene Dimere, die den Wachstumshormonrezeptor nicht binden oder aktivieren können. HGH ohne Disulfidbrücken hatte eine nur gering reduzierte Bioaktivität, allerdings eine deutliche verringerte Resistenz gegenüber Trypsinverdau. Schlussfolgerungen: Die Disulfidbrücken im Wachstumshormon sind nicht essentiell für die Bindung und Aktivierung des Wachstumshormonrezeptors, da die Bioaktivität ohne Disulfidbrücken nur gering reduziert ist. Sie sind allerdings entscheidend für die strukturelle Stabilisierung des Moleküls zum Schutz vor proteolytischen Abbau, was essentiell für die Aufrechterhaltung von ausreichenden hGH-Spiegeln in der Zirkulation im Organismus sein könnte. Die molekularen Mechanismen, die einen angeborenen Wachstumshormonmangel durch Cysteinmutationen im Wachstumshormon bedingen sind vielfältig und schließen die erstmals beschriebene Bildung eines bioinaktiven Wachstumshormondimers ein.
Background: HGH contains two disulfide bridges, which are highly conserved among species and are also found in prolactin. It is well established, that hGH with reduced and alkylated cysteines, therefore devoid of disulfide bonds, has almost full wildtype bioactivity in animal models. For this study, we identified published cases of patients with Inherited Growth Hormone Deficiency and mutations of the cysteines in the hGH-molecule. We then conducted a number of studies to identify the underlying mechanisms. Additionally, we investigated the properties of hGH lacking all disulfide bonds, without disrupting them chemically. Methods: Plasmids containing hGH-cDNA matching the cDNA of the affected individuals were generated using site-directed mutagenesis. To generate hGH devoid of all disulfide bonds, we replaced all triplets encoding cysteine with triplets encoding alanine. Mutant growth hormone was then expressed in pituitary AtT20 as well as GC cells and analysed by immunohistology, immunoassay and western-blotting. hGH and hGH-variants generated in CHO-K1 and HEK cells were purified and used to examine their bioactivity in Baf-B03 cells stably expressing the GHR and Nb2 cells expressing a truncated prolactin receptor. Receptor binding of the mutants was studied in competition assays with GHBP (growth-hormone binding protein). To determine the stability of the mutants they were subjected to trypsin digestion. Results: Our extensive analysis revealed a variety of mechanisms which are responsible for the loss of biological function of the hGH variants. Some hGH-variants showed greatly reduced expression and secretion in pituitary cells, others showed significantly reduced affinity to the GHR and a reduction in bioactivity. Most strikingly, the hGH-C53S variant forms disulfide-linked dimers which are unable to bind and activate the GHR. HGH completely devoid of disulfide-bonds only had slightly diminished bioactivity compared to hGH-wt, however resistance to trypsin digestion was greatly reduced. Conclusions: The disulfide bonds in hGH are not essential to for binding to- and activate activation of the GHR, as the bioactivity of cysteine-free hGH is only moderately reduced. However, they these are structurally stabilizing the hormone by rescue from proteolytic cleavage, which might be essential for the maintainance of circulating hGH levels in vivo. The molecular mechanisms underlying Inherited Growth Hormone Deficiency caused by cysteine mutation are diverse and include the newly discovered formation of a bioinactive hGH-dimer.
