N-terminal acetylation is one of the most abundant protein modifications in eukaryotes, affecting an estimated 80% of all human proteins and has diverse implications for the stability, folding, half-life, interaction ability and subcellular targeting of the acetylated protein. This irreversible modification is catalysed by a highly conserved family of N-terminal acetyltransferases (NATs). Eight different NATs have been described in eukaryotes so far, which differ in their substrate specificity, their subunit composition and their subcellular localization. The only major eukaryotic NAT that has thus far eluded structural determination, is the heterotrimeric NatC complex, consisting of the catalytic subunit Naa30 and the two auxiliary subunits Naa35 and Naa38. In this work, five structures of the Saccharomyces cerevisiae NatC complex in the absence and presence of CoA and two peptide substrates are presented. The structural analyses show that the large auxiliary subunit Naa35 is the central assembly hub of NatC that forms extensive interactions with the catalytic subunit Naa30 and the small auxiliary subunit Naa38. Thus, Naa35 wraps around Naa30 in an open ring-like tertiary structure and its N-terminus embraces Naa38 around almost its entire circumference. Most strikingly, the architecture of the NatC complex completely differs from that of the heterodimeric NAT complexes NatA and NatB. Most importantly, the position of the NatC auxiliary subunit relative to the catalytic subunit shows the exact opposite arrangement seen in the NatA and NatB auxiliary subunits. NatC structures in complex with two cognate peptides corresponding to the N-terminus of yeast Arl3 and the viral Gag protein provided structural insight into NatC substrate specificity and show that the peptides are bound in an elongated hydrophobic substrate binding pocket that is formed in between subunits Naa30 and Naa35. Binding of the high-affinity Gag peptide, but not of the Arl3 peptide, resulted in large ligand-induced structural rearrangements of the substrate binding loop. Accordingly, in acetyltransferase assays, the Gag peptide displayed a 10-fold increased catalytic efficiency compared to Arl3. Based on a comprehensive structure-function study, a catalytic mechanism for the NatC complex was proposed. Finally, by comparing the NatC structure to the ribosome-bound NatA structure and supported by structure-based mutagenesis, a model for the ribosome-bound NatC complex is presented.
Die N-terminale Acetylierung ist eine der am häufigsten vorkommenden Proteinmodifizierungen in Eukaryoten, welche geschätzte 80% aller humanen Proteine betrifft und weitreichende Auswirkungen auf die Stabilität, Faltung, Lebensdauer, das Interaktionsvermögen und die subzelluläre Verteilung des acetylierten Proteins hat. Diese irreversible Modifikation wird von einer stark konservierten Familie N-terminaler Acetyltransferasen (NATs) katalysiert. Acht verschiedene NATs wurden bisher in Eukaryonten beschrieben, welche sich durch ihre Substratspezifität, Untereinheiten-Zusammensetzung und ihre subzelluläre Lokalisation unterscheiden. Die einzige eukaryotische N-terminale Acetyltransferase die bisher nicht strukturell charakterisiert werden konnte, ist der heterotrimere NatC-Komplex, welcher aus der katalytischen Untereinheit Naa30 und den beiden unterstützenden Untereinheiten Naa35 und Naa38 besteht. In dieser Arbeit werden fünf verschiedene Strukturen des Saccharomyces cerevisiae NatC-Komplexes in Gegenwart und Abwesenheit von Coenzyme A und zwei Substratpeptiden vorgestellt. Die strukturelle Analyse zeigt, dass die große Neben-Untereinheit Naa35 die zentrale strukturgebende Funktion einnimmt und umfangreiche Interaktionen mit der katalytischen Untereinheit Naa30 und der kleinen Untereinheit Naa38 eingeht. Naa35 umhüllt auf diese Weise Naa30 in einer offen-ringförmigen Tertiärstruktur. In ähnlicher Weise wickelt sich der N-terminus von Naa35 fast vollständig um den gesamten Kreisumfang von Naa38. Zwei NatC Strukturen im Komplex mit Peptiden der natürlichen Substrate Arl3 (aus Hefe) und dem viralen Gag-Protein ermöglichen einen strukturellen Einblick in die Substratspezifität von NatC und zeigen weiterhin die Bindung der beiden Peptide in einer langgestreckten, hydrophoben Substrat-Bindetasche, welche zwischen den beiden Untereinheiten Naa35 und Naa38 gebildet wird. Die Bindung des Gag-Peptides, aber nicht die von Arl3, resultiert in einer großen Ligand-induzierten strukturellen Neuordnung der Substrat-Bindeschlaufe. Demgemäß zeigt das Gag-Peptid eine zehnfach erhöhte katalytische Effizienz im Vergleich zu Arl3. Auf Basis der umfangreichen Struktur-Funktions-Studien wurde ein katalytischer Mechanismus für den NatC Komplex vorgeschlagen. Aufgrund des Vergleichs der NatC-Struktur mit der Ribosom-gebundenen NatA-Struktur, unterstützt durch strukturbasierte Mutagenese, wird ein Modell für den Ribosomen-gebundenen NatC Komplex präsentiert.
