Molekulare Charakterisierung des Glucosamin-6-Phosphat-Desaminase-Gens (NAG1) in C. albicans

Abstract

Die Umwandlung von Glucosamin-6-Phosphat zu Fructose-6-Phosphat durch das Enzym Glucosamin-6-Phosphat-Desaminase (GNPDA) ist ein wichtiger Schritt im katabolen Stoffwechsel von N-Acetylglucosamin (GlcNAc) und Glucosamin (GlcN). Normalerweise sind C. albicans-Stämme in der Lage, diese beiden Aminozucker als Kohlenstoffquelle zu nutzen. Die Arbeitsgruppe um Tietz beschrieb morphologisch atypische C. albicans aus Afrika, die GlcNAc und GlcN nicht verwerten konnten und weniger virulent als die typischen C. albicans aus der gleichen Region erschienen [Tietz et al., 1995]. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Suche nach Mutationen im NAG1-Gen, welches die GNPDA kodiert, oder Veränderungen in der Genexpression, die die mangelnde Assimilation von GlcNAc und GlcN in den atypischen Stämmen erklären könnten. Bestimmungen der Enzymaktivität zeigten eine verminderte Induzierbarkeit der GNPDA durch GlcNAc bei den atypischen Stämmen, jedoch ist eine Grundaktivität bei allen Stämmen nachweisbar. Anhand der von Natarajan und Datta (1993) für C. albicans publizierten NAG1-Sequenz wurden spezifische Primer für die Amplifizierung dieses Gens für DNA- und mRNA-Analysen in verschiedenen typischen und atypischen Stämmen entwickelt. Untersuchungen zur Expression des NAG1-Gens ergaben keine signifikanten Unterschiede in der mRNA-Konzentration zwischen typischen und atypischen (mit GlcNAc-induzierten und nicht induzierten) Stämmen. Um nach Polymorphismen in der DNA-Sequenz zu suchen, wurden die von typischen und atypischen Stämmen erhaltenen PCR-Produkte zunächst einer SSCP- Analyse unterzogen. Alle GlcNAc- und GlcN-negativen Stämme, mit Ausnahme von 2 Stämmen, hatten ein identisches SSCP-Muster, während die getesteten typischen Stämme unterschiedliche, fast individuelle SSCP-Muster zeigten. Bei der Sequenzierung der amplifizierten NAG1-PCR-Produkte wurden bei den atypischen Stämmen, im Vergleich zu den typischen C. albicans, drei Mutationen in der Aminosäure-Sequenz nachgewiesen. Diese Mutationen können eine veränderte Konformation des Enzyms und damit eine reduzierte Induzierbarkeit zur Folge haben.

The conversion of glucosamine-6-phosphate into fructose-6-phosphate catalyzed by the enzyme glucosamine-6-phosphate deaminase (GNPDA) is an important step in the N-acetyl-glucosamine (GlcNAc) and glucosamine (GlcN) catabolic pathway. Normally, C. albicans strains are able to utilize these two aminosugars as the sole carbone source. The work group of Tietz described morphologically atypical C. albicans strains from Africa which seemed to be less virulent than typical C. albicans strains from the same geographical area [Tietz et al., 1995]. The objective of this study was to search for mutations in the NAG1 gene, which the GNPDA encodes, or for changes in the gene regulation that may explain the inability of GlcNAc- and GlcN-negative strains to assimilate the two amino sugars. The ability to induce GNPDA through GlcNAc is reduced in the atypical strains. However, in all uninduced strains, typical and atypical, an activity of GNPDA was detectable. Specific PCR primers, based on sequences of the NAG1 gene published by Natarajan and Datta (1993), were designed for the amplification of the NAG1 gene DNA and mRNA in various typical and atypical C. albicans strains. The analysis of the gene-expression showed no significant differences in the concentrations of mRNA in both populations (GlcNAc induced and not induced). To test for sequence polymorphisms, the amplification products were subjected to an sscp analysis. All GlcNAc- and GlcN-negative strains with the exception of two strains had an identical but unique sscp pattern, whereas all typical strains tested showed varying, almost individual sscp patterns. Sequencing of the amplified NAG1 genes of GlcNAc- and GlcN- negative strains did reveal three mutations in the amino acid sequence compared to the gene amplified from typical strains, which could provoke a change of conformation in the enzyme and therefore a reduced induction may be the consequence.