In this dissertation, we investigated the significance of long-range communication in macromolecules’ conformational dynamics by means of molecular simulations. At the molecular level, these cooperative long-range interactions are delineated to be important in the regulation of biological systems [5, 11, 12]. The primary goal was to determine how the transmission of these long-range effects is manifested in conformational stability and characteristic dynamic properties of the studied macromolecular systems, which, in the light of this thesis, are: (1) Cytochrome c oxidase (CcO), a membrane protein in the respiratory chain of mitochondria, (2) Androgen (AR) and Glucocorticoid (GR) receptors DNA binding domain DNA complexes. To obtain a noteworthy insight about the interactions underlying such intra and intermolecular communication mechanisms, molecular dynamics (MD) simulation of studied systems have been performed and subsequently analyzed. CcO system, In CcO the transfer of protons towards the binuclear redox center (BNC), for the reduction reaction of dioxygen to water, or towards a proton loading site, for transferring protons through the membrane, occurs within two distinct pathways, the D- and K-channels. Yet, despite many experimental and computational studies on CcO [33, 83, 86, 88, 90, 141, 142], the mechanism underlying such proton transfer and protonation-state dependent action of key residues inside channels and their possible inter/intra communication is not yet clearly understood. To this, in our study, MD simulations of CcO (in the first step of the redox cycle, i.e. P R →F state) with 16 different combinations of the protonation state of the key residues, i.e. D132, E286 (D-channel), E101 and K362 (K-channel), have been performed and analyzed. This allows us to mimic the proton transfer through the channels. The result of our simulations indicates that the conformational dynamics and communication of the channel residues in CcO depend on a combination of their protonation state rather than on individual residue’s protonation state. This cooperative behaviour is especially seen among the residues within the same channel. In particular, within the D-channel, a substantial conformational dependency of residue N139 on protonation states of the terminal residues, i.e. D132 and E286, can be observed; suggesting a gating role of N139. On the other side, a significant coupling of the hydrogen-bond dynamics of N139 with respect to the protonation state of the residue K362 in K-channel has been observed [34]. Together, the protonation-state dependent communication between these distal-site pairs might explain the regulation of proton release from the D-channel in the P R →F transition. Protein-DNA system, Site-specific binding of short DNA sequences by transcription factor proteins facilitates gene regulation in the cell. AR and GRs are ligand-activated transcription factors which bind as homo-dimers to DNA with a repeated recognition sequence, spaced by a few base pairs. Despite the structural similarity of the two proteins’ DNA binding domains, the AR binds to DNA with a direct repeat, whereas the GR fails to do so. Our simulations suggest that long-ranged communication in the protein-protein-DNA complexes plays an important role in recognition and specificity. We could reveal an altered shape of the DNA spacer in the direct repeat sequence. A conformational change in one loop, called lever arm, of the GR’s DNA binding domain leads to an erroneous binding to the DNA spacer. The resulting tilt of one protein subunit into a distorted conformation impairs the protein-protein interactions and thus the stability of the complex. The different composition of the respective loop in the androgen receptor prevents such distorting interactions to the DNA spacer, maintaining the conformation of the protein-DNA complex. Both proteins show intact complexes when bound to an inverted repeat DNA sequence. A chimeric AR protein, termed SPARKI, in which the second zinc-binding motif of AR (dimer interface) is swapped with that of GR fails to recognize direct repeat-like elements. This is unlike AR that makes specific contacts with these sequences but rather like GR that fails to make such contacts [47]. Therefore, the question arises whether the dimer interface is a main factor in the distinct recognition of AR and GR toward a direct repeat sequence. Thus, studying the SPARKI receptor allowed us to better understand the role of the AR-like and GR like domains in the distinct recognition mechanisms of AR and GR. The results of our simulations show that the competition between a strong (or flexible) dimer interface versus distinct direct protein-DNA is an essential factor for the dimeric protein to allow proper accommodation on DNA. However, the stability of the dimerization interface plays a predominant role as supported by the fact that all complexes exhibit rather similar specific contacts with DNA. A SPARKI model built from the structure of the GR, i.e. SPARKI-GR, shows a considerable distortion in its dimerization domain when complexed to a direct repeat sequence. On the other hand, a SPARKI model based on the AR, i.e. SPARKI-AR, shows significantly fewer protein-protein and protein-DNA hydrogen bond interactions when complexed with direct repeat sequence than with inverted repeat. The diminished interaction of SPARKI-AR with and the instability of SPARKI-GR on direct repeat response elements agree with SPARKI’s lack of affinity for these sequences. The more GR-like binding specificity of the chimeric SPARKI protein is further emphasized by both SPARKI models binding even more strongly to inverted repeat elements than observed for the DNA binding domain of the GR. GR activity modulation depends on DNA sequence of its binding site. Different core specific-sequence composition and the DNA shape, ‘read-out’ through non-specific DNA contacts, was proved to be key factors in modulating the GR activity. In this regard, a sequence flanking to the core specific sequence might play an important role in GR structure and its interaction with DNA. Our simulations suggest significant long-range communication between the specific protein-DNA core site and its proximal flanking base pairs. In this regard, we could reveal an altered shape of the core DNA sequence due to different flanking elements. Nevertheless, the impact of DNA-shape variation results not in direct protein-DNA interaction (via hydrogen-bonds) but rather repositioning of the dimer GR DNA-binding domains. Interestingly, such altered protein-DNA conformation has been mainly observed in the complex’s second half-site, pointing out the predominant role of direction flanking nucleotide in the GR structure and conformation. Our MD simulations and their outcome results afforded us to understand the detailed interactions at atomic-detail that are governing long-range effects.
In dieser Doktorarbeit haben wir mit Hilfe von Molekülsimulationen die Bedeutung von langreichweitiger Kommunikation in der Konformationsdynamik von Makro-molekülen untersucht. Kooperative langreichweitge Wechselwirkungen sind auf der molekularen Ebene wichtig für die Regulation biologischer Systeme [5, 11, 12]. Das primäre Ziel war es, herauszufinden, wie sich die Transmission dieser Fernwirkungen in der Konformationsstabilität und den charakteristischen dynamischen Eigenschaften der im Rahmen dieser Arbeit untersuchten makromolekularen Systeme niederschlägt. Bei den Systemen handelt sich zum einem um die (1) Cytochrom-c-Oxidase (CcO), ein Membranprotein der mitochondrialen Atmungskette, und zum anderen um die (2) DNA-Bindedomänen der Androgen- (AR) und Glukokortikoid(GR) Rezeptoren im Komplex mit DNA. Um einen aussagekräftigen Einblick in die Wechselwirkungen zu erhalten, die solchen intra- und intermolekularen Kommu- nikationsmechanismen zugrunde liegen, wurden Molekulardynamik- (MD) Simulationen der beschriebenen Systeme durchgeführt und anschließend analysiert. CcO system, Der Protonentransfer innerhalb der CcO erfolgt auf zwei verschiedenen Wegen, dem D- und dem K-Kanal. Die Protonen gelangen so zum binuklearen Redoxzentrum für die Reduktionsreaktion von Dioxygen zu Wasser oder in Richtung einer Protonenladestelle zum Transfer durch die Membran. Trotz einer Vielzahl an experimentellen und computerbasierten Studien zur CcO [33, 83, 86, 88, 90, 141, 142] , ist der dem Protonentransfer zugrundeliegende Mechnismus und das Verhalten von Schlüsselresiduen in Abhängigkeit ihres Protonierungszustands sowie deren mögliche Inter- und Intrakommunikation nicht ausreichend verstanden. Dazu wurden in unserer Studie MD-Simulationen der CcO (im ersten Schritt des Redoxzyklus, also im Übergang P R →F state) in 16 verschiedenen Kombinationen von Protonierungszuständen der Schlüsselresiduen durchgeführt und analysiert. Bei den Schlüsselresiduen handelt es sich um D132 und E286 im D-Kanal sowie E101 und K362 im K-Kanal. Die Simulationen ermöglichen es uns, den Protonentransfer durch die Kanäle nachzubilden. Die Ergebnisse unserer Simulationen zeigen, dass die Konformationsdynamik und Kommunikation der Kanalresiduen von einer Kombination an Protonierungszuständen der Schlüsselresiduen abhängen anstatt von deren individuellen Protonierungszuständen. Dieses kooperative Verhalten zeigt sich vor allem bei den Residuen innerhalb desselben Kanals. Insbesonere innerhalb des D-Kanals hängt die Konformation von N139 von den Protonierungszuständen der Anfangs- und Endresiduen, also D132 und E286, ab; das deutet auf eine Gating-Rolle von N139 hin. Außerdem konnte eine signifikante Kopplung der Wasserstoffbrückendynamik von N139 mit dem Protonierungszustand von K362 im K-Kanal beobachtet werden [34]. Zusammengenommen könnte die protonierungszustandsabhängige Kommunikation zwischen diesen voneinander entfernten Stellen die Regulation der Protonenfreisetzung aus dem D-Kanal im P R →F Übergang erklären. Protein-DNA system, Die ortsspezifische Bindung von kurzen DNA-Sequenzen durch Transkriptionsfaktoren ermöglicht die Genregulation in der Zelle. ARs und GRs sind ligandenaktivierte Transkriptionsfaktoren, die als Homodimere an DNA mit einer sich nach wenigen Basenpaaren (Spacer) wiederholende Erkennungssequenz binden. Trotz der strukturellen Ähnlichkeit der DNA-Bindedomänen beider Proteine kann AR im Gegensatz zu GR an DNA mit einem direct Repeat binden. Unsere Simualtionen deuten darauf hin, dass langreichweitige Kommunikation in den Protein-Protein-DNA-Komplexen eine wichtige Rolle für Erkennung und Spezifität spielt. Wenn GR an eine direct-Repeat-Sequenz bindet, so kann eine Verformung der Spacer-DNA beobachtet werden. Eine Konformationsänderung in einer Loop der DNA-Bindedomäne, dem sogenannten Lever-arm, des GR führt zu einer fehlerhaften Bindung an die Spacer-DNA. Die daraus resultierende Verkippung eines der Monomere in eine verzerrte Konformation beeinträchtigt die Protein-Protein Wechselwirkungen und damit die Stabilität des gesamten Komplexes. Die davon abweichende Zusammensetzung der entsprechenden Loop im Androgenrezeptor verhindert solcherlei gestörte Wechselwirkungen mit der Spacer-DNA und bewahrt so die Konformation des Protein-DNA-Komplexes. Beide Proteine bilden intakte Komplexe, wenn sie an inverted-Repeat-DNA-Sequenzen gebunden sind. SPARKI, ein chimäres AR-Protein, bei dem das zweite Zinkfinger-Motiv (Dimer-Interface) des AR durch das des GR ersetzt ist, erkennt keine direct-Repeat-DNA-Sequenzen. SPARKI verhält sich also wie GR, das im Gegensatz zu AR keine spezifischen Kontakte mit diesen Sequenzen herstellt [47]. Somit stellt sich die Frage, ob das Dimer-Interface einen Hauptfaktor in der eindeutigen Erkennung des direct Repeat durch AR und GR darstellt. Der untersuchte SPARKI-Rezeptor hat es uns erlaubt, die Rollen der AR- und GR-artigen Domänen in den Erkennungsmechanismen von AR und GR zu verifizieren. Die Ergebnisse unserer Simulationen zeigen, dass die Konkurrenz zwischen der Flexibilität des Dimer-Interfaces und den direkten Protein-DNA-Wechselwirkungen einen entscheidenen Faktor für die passgenaue Unterbringung des Dimers auf der DNA darstellt. Die herausragende Rolle des Dimer Interfaces wird zusätzlich dadurch unterstützt, dass alle Komplexe änhliche spezifische Kontakte mit der DNA aufweisen. Ein SPARKI-Modell, das von einer GR-Kristallstruktur ausgehend gebaut wurde (SPARKI-GR), zeigt eine erhebliche Verformung in seiner Dimerisationsdomäne, wenn es an einen direct Repeat gebunden ist. Ein SPARKI-Modell, das hingegen auf einer AR-Kristallstruktur basiert (SPARKI-AR), zeigt deutlich weniger Protein-Protein- und Protein-DNA-Wasserstoffbrücken im Komplex mit einem direct Repeat im Vergleich zu einem inverted Repeat. Die verminderte Wechselwirkung von SPARKI-AR und die Instabilität von SPARKI-GR bestätigen die mangelnde Affinität von SPARKI zu direct-Repeat Sequenzen. Die GR-ähnliche Bindungsspezifität des chimären SPARKI-Proteins wird noch dadurch unterstrichen, dass beide SPARKI-Modelle noch stärker an inverted Repeat-Elemente binden als für die DNA-Bindedomäne des GR beobachtet. Die GR-Aktivitätsmodulation hängt von der DNA-Sequenze seiner Bindungstelle ab. Verschiedene Core-spezifische Sequenzstrukturen und die DNA-Form, die durch nicht-spezifische DNA-Kontakte ’gelesen’ wird, haben sich als Schlüsselfaktoren für die Modulation der GR-Aktivität erwiesen. In diesem Kontext könnte die Sequenz, die die Core-spezifische Sequenz flankiert, eine wichtige Rolle für die GR-Struktur und dessen Wechselwirkung mit DNA spielen. Unsere Simulationen weise auf eine erhebliche langreichweitige Kommunikation zwischen der spezifischen Protein-DNA Kern Sequenz und ihren nahen flankierenden Basenpaaren hin; wir konnten eine veränderte Form der Kern-DNA-Sequenz aufgrund der flankierenden Basenpaare erkennen. Dennoch führt der Einfluss der DNA-Formveränderung nicht zu direkter Protein-DNA-Wechselwirkung (via Wasserstoffbrücken), sondern vielmehr zu einer Repositionierung der dimeren GR-DNA-Bindedomänen. Bemerkenswerterweise wurde eine solche veränderte Protein-DNA-Konformation hauptsächlich in der zweiten Hälfte des Komplexes beobachtet, was auf eine vorherrschende Rolle der -Richtung flankierenden Nukleotide für die GR-Struktur und -Konformation hinweist. Unsere MD Simulationen und deren Analyseergebnisse haben es uns ermöglicht, diejenigen detaillieren Wechselwirkungen, welche die langreichweitigen Effekte dominieren, auf Atomlevel zu verstehen.
