Biologische Toxine verursachen als maßgebliche Pathogenitätsfaktoren schwere Erkrankungen im Menschen. Die Aufnahme der Toxine kann akzidentell oder nach intentionaler Ausbringung im Rahmen bioterroristischer Anschläge erfolgen. Orale Intoxikationen mit den Pflanzentoxinen Rizin und Abrin führen zu blutigen Durchfällen mit Leukozyten im Stuhl. Diese unspezifische Symptomatik kann auch auf natürlicherweise auftretende Gastroenteritiden durch Shigatoxin (Stx) produzierende Bakterien sowie durch die von Clostridium perfringens produzierten Toxine Clostridium perfringens Enterotoxin (CPE) und Epsilon Toxin (Etx) zurückzuführen sein. Zur Abgrenzung zwischen natürlichen und intentionalen Krankheitsgeschehen ist eine schnelle Differentialdiagnostik notwendig, welche bisher nicht verfügbar ist. Besondere Herausforderungen liegen in der hohen Toxizität der untersuchten Toxine sowie in der Tatsache, dass biologische Toxine oft in strukturell unterschiedlichen Varianten vorkommen, die alle sicher erfasst werden müssen. Ziel dieser Arbeit war es, stationäre und mobile Nachweisverfahren für Rizin, Abrin, Stx, CPE und Etx auf Basis monoklonaler Antikörper (mAk) und endogener Rezeptorstrukturen zu etablieren und vergleichend zu erproben.
Hierzu wurden im Rahmen der Arbeit neu generierte oder kommerziell verfügbare mAk in laborbasierte Immunoassays integriert und für den schnellen Nachweis in ein multiplexfähiges Vor Ort System (pBDi, Bruker Daltonik) übertragen. Geeignete mAk wurden auf Grundlage der kinetischen Bindungseigenschaften sowie distinkter Epitoperkennung identifiziert. Da das Auftreten von Toxinvarianten die Detektion durch hochspezifische mAk beeinträchtigen kann, wurden die funktionellen endogenen Rezeptoren der jeweiligen Toxinfamilien als innovative Fängerstrukturen erprobt. Analog zu den mAk wurden Proteinrezeptoren oder in Phospholipidnanodisks integrierte Glykosphingolipide hinsichtlich ihrer Bindungseigenschaften charakterisiert und optimale Bedingungen für hochaffine Interaktionen identifiziert.
Für alle adressierten Toxine gelang die Etablierung Antikörper basierter Immunoassays mit exzellenten Detektionslimits im unteren pg/ml Bereich. Mit Ausnahme von Etx konnten zudem hochaffine Rezeptorinteraktionen identifiziert und in Kombination mit monoklonalen Detektionsantikörpern für laborbasierte Nachweise mit vergleichbaren Sensitivitäten funktionalisiert werden. Die Erkennung von nativem CPE und Etx wurde mit einem Panel an Bakterienüberständen verifiziert. Die breitbandige Erkennung von Stx Toxinvarianten (Stx1 a, c, d; Stx2 a g) durch die Antikörper und Rezeptor basierten Immunoassays wurde mit Hilfe von Bakterienüberständen überprüft. Es gelang eine lückenlose Detektion sowohl unter Verwendung der endogenen Rezeptoren, als auch durch oligoklonale Mischungen von mAk. Die Übertragung der mAk basierten Nachweissysteme in das pBDi System ermöglichte eine schnelle Vor Ort Detektion aller Toxine mit Nachweisgrenzen im ng/ml Bereich. Einer der untersuchten Rezeptoren (Claudin 4 als Rezeptor für CPE) konnte mit gleicher Sensitivität in das Vor Ort System transferiert werden. Für die in dieser Arbeit adressierten Toxine wurde demonstriert, dass mAk und endogene Rezeptoren einen breitbandigen Nachweis ermöglichten und je nach untersuchtem Toxin in die Vor Ort Detektionsplattform übertragbar waren. Auf Grundlage dieser Ergebnisse ist es erstmals möglich, eine relevante Palette von bakteriellen und pflanzlichen Toxinen, die blutige Durchfälle auslösen, spezifisch und sensitiv mit all ihren Toxinvarianten zu erfassen. Die Realisierung des Vorhabens stellt einen zentralen Beitrag zur Unterstützung von Expertenlaboren und Einsatzkräften vor Ort dar, um durch Toxine ausgelöste intentionale Geschehen von natürlichen Krankheitsausbrüchen zu unterscheiden.
Biological toxins are essential pathogenicity factors often contributing critically to severe human diseases. The uptake of toxins can occur accidentally, e.g. in food-borne intoxications, or intentionally by bioterrorism attacks . Intoxications caused by oral ingestion of the plant toxins ricin and abrin lead to bloody diarrhea and leucocytes in the stool. However, these unspecific symptoms are also associated with naturally occurring gastroenteritis caused by Shigatoxin (Stx) producing bacteria as well as Clostridium perfringens Enterotoxin (CPE) and Epsilon toxin (Etx) produced by Clostridium perfringens. To discriminate naturally occurring from intentional intoxications caused by ricin or abrin, a rapid differential diagnosis targeting a panel of relevant toxins would be needed but is lacking to date. In fact, detection of biological toxins is challenging due to their high toxicity and the existence of structurally different toxin variants, all of which must be detected reliably. To this aim, the objective of this work was to establish and compare both stationary and mobile detection methods for ricin, abrin, Stx, CPE and Etx based on monoclonal antibodies (mAbs) and endogenous receptor structures.
In this work, newly generated or commercially available mAbs were integrated into laboratory-based immunoassays and implemented in a fast and multiplex on-site detection system (pBDi, Bruker Daltonik). Suitable mAbs were identified based on kinetic binding properties and distinct epitope recognition. Since the occurrence of structurally heterogeneous toxin variants can impair detection by highly specific mAbs, the functional endogenous receptors of the respective toxin families were tested as innovative capture structures. Analogous to the mAbs, protein receptors or glycosphingolipids integrated into phospholipid nanodiscs were characterized with respect to their binding properties and optimal conditions for high-affinity interactions were identified.
For all toxins addressed the establishment of antibody-based immunoassays was successful with excellent detection limits in the low pg/ml range. Additionally, apart from Etx, high-affinity receptor interactions were identified, characterized and combined with monoclonal detection antibodies for toxin detection. Subsequently, the detection of native CPE and Etx was verified with a panel of bacterial supernatants. Along the same line, using bacterial supernatants from E.coli strains broad detection of distinct Stx toxin variants (covering Stx1 a, c, d; Stx2 a-g) was verified successfully by both antibody and receptor based immunoassays. Implementation of the mAb-based detection assays into the pBDi system enabled fast on-site detection of all toxins with detection limits in the ng/ml range. Additionally, one of the receptors investigated (Claudin 4 as receptor for CPE) could be transferred into the on-site system achieving the same sensitivity.
In conclusion, it was demonstrated for all toxins addressed in this work that mAbs and endogenous receptors enabled broad detection of toxins / toxin subtypes and, depending on the toxin under investigation, could be transferred to an on site detection platform. Based on these results, it is now for the first time possible to detect a comprehensive panel of bacterial and plant toxins causing bloody diarrhea covering all relevant toxin variants, both specifically and sensitively. The outcomes of this project strengthen technical capacities of expert laboratories and first responders and help to distinguish intentional bioterrorism incidents triggered by biological toxins from natural disease outbreaks.
