Einleitung: Die infektiöse Endokarditis (IE) ist trotz Fortschritte der antimikrobiellen und chirurgischen Therapie weiterhin mit einer hohen Morbidität und Mortalität assoziiert. Die IE ist eine Biofilm-basierte, bakterielle Infektion des Endokards, v.a. Aorten- und Mitralklappe werden besiedelt. Die Besiedlung führt oft zu Funktionsstörungen der Herzklappe bis hin zu einer Herzinsuffizienz. Insbesondere für Patienten, die trotz formaler Operationsindikation nicht mit einer Klappenprothese versorgt werden können, werden alternative Therapieverfahren benötigt. Forschungsprojekte in diesem Bereich sind aufgrund der fehlenden Verfügbarkeit geeigneter Modelle jedoch bisher nur eingeschränkt möglich. Das Ziel dieser Arbeit war es, ein pulsatiles in vitro – Modell der infektiösen Endokarditis zu etablieren, in dem unter physiologischen hämodynamischen Bedingungen standardisiert bakterielle Biofilme auf porcinen Aortenwurzeln erzeugt werden. Dieses Modell soll Grundlage für weitere Forschungsvorhaben sein.
Methoden und Ergebnisse: Es wurde ein pulsatiles Zwei-Kammer-Kreislaufmodell konstruiert, in dem porcine Aortenklappen einer physiologischen Hämodynamik ausgesetzt wurden. In n=3 Sterilitätstests wurde steriles Kulturmedium über 24 h im System bewegt. Das Medium zeigte makroskopisch keine Zeichen mikrobiellen Wachstums und in der Kultur konnte kein Erregerwachstum festgestellt werden. Es folgten n=4 Etablierungsversuche zur Biofilmerzeugung auf porcinen Aortenklappen mit Staphylococcus epidermidis PIA 8400 unter steigender Zeitdauer (24 h, 40 h) und Inokulum (1,5x104 CFU/ml, 1,5x105 CFU/ml) bei einem Herzminutenvolumen von 5 l. Anschließend wurden n=3 Versuche zur Reproduktion der Biofilme mit gleicher Versuchsdauer (24 h) und Inokulum (1,5x105 CFU/ml) durchgeführt. Nach den Versuchen wurden Gewebeschnitte der Aortenwurzeln mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) auf bakterielle Biofilme untersucht. Die spezifische Erregerbestätigung erfolgte mittels FISH, Kultur und 16S rRNA-PCR mit Sequenzierung. Die n=4 Etablierungsversuche zeigten eine kokkoide Monospezies-Besiedlung der Herzklappen, deren Intensität zeit- und inokulumabhängig anstieg. Die n=3 Reproduktionsversuche zeigten Biofilme mit aktiven Kokken und einem Besiedlungsmuster vergleichbar mit dem einer humanen IE, wie sie mit der FISH nach einer Infektion mit S. epidermidis beobachtet wurde.
Diskussion: Es wurde erstmalig ein pulsatiles in vitro – Modell der infektiösen Endokarditis etabliert, mit dem in vitro das Wachstum bakterieller Biofilme von ausgewählten Mikroorganismen auf porcinen Aortenwurzeln in toto möglich ist und das darüber hinaus das Besiedlungsmuster einer humanen IE simuliert. Das Modell soll als Grundlage dienen, um neue Therapieoptionen der IE zu evaluieren, z.B. eine perkutan implantierbare, antiinfektive Transkatheterklappe. Auch die Evaluation von antimikrobiellen Beschichtungen auf Klappenprothesen zur Infektionsprävention ist möglich und das System kann neue Einblicke in die Pathogenese der IE gewähren, z.B. über die Lokalisation von Prädilektionsstellen der bakteriellen Adhäsion an der Klappe und des Biofilmwachstums.
In spite of the progress in antimicrobial and surgical therapy, infective endocarditis (IE) is still associated with a high morbidity and mortality. IE is characterized by bacterial biofilms of the endocardium, especially of the aortic and mitral valve leading to destruction of the valve. Current research demonstrates that about one quarter of the patients with formal surgery indication cannot undergo surgery. This group of patients needs further options of therapy, but due to a lack of models for IE prospects of research are low. Therefore, the purpose of this project was to establish an in vitro – model of infective endocarditis to allow growth of bacterial biofilms on porcine aortic valves, serving as baseline for further research. Methods and Results: A pulsatile two-chamber circulation model was constructed that kept porcine aortic valves under sterile, physiologic hemodynamic and temperature conditions. To exclude external contamination, sterility tests (n=3) with sterile culture media were performed for 24 h. No growth of microorganisms was observed in the system and cultures after plating on standard media remained negative. To create biofilms on aortic valves the system was inoculated with Staphylococcus epidermidis PIA 8400. Porcine aortic roots were incubated in this system for increasing periods of time (24 h, 40 h) and bacterial titration (1,5x104 CFU/ml, 1,5x105 CFU/ml) with 5 l cardiac output per minute. After incubation, specimens were embedded and tissue sections were analyzed by Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct pathogen detection and visualization of the biofilms. Monospecies colonization was confirmed by FISH, culture and 16S rRNA-PCR with sequencing. To demonstrate reproducibility of created biofilms further trials with same duration and titration were performed. The first tests for biofilm growth showed monospecies colonization consisting of cocci with time- and inocula- dependent increasing after 24 h and 40 h (n=4). In n=3 experiments for 24 h with same inocula FISH visualized biofilms with ribosome-containing, and thus active cocci, tissue infiltration and similar colonization pattern as observed by FISH in human IE heart valves infected by S. epidermidis. Conclusion: These results demonstrate the establishment of a novel in vitro – model for bacterial biofilm growth on porcine aortic roots and furthermore simulating human IE colonization pattern. The model will allow to identify predilection sites of valves for bacterial adhesion and biofilm growth and it may serve as baseline for further research on IE therapy and prevention, e.g. the development of antimicrobial transcatheter approaches to IE. (1, 2)
