Das Glioblastoma multiforme (GBM) ist der häufigste und zugleich aggressivste Tumor unter allen malignen Tumoren des ZNS. Trotz intensiver Forschung liegt das mediane Überleben nach Diagnosestellung bei ca. einem Jahr. Gliome bestehen grundsätzlich nicht nur aus Tumorzellen, sondern auch aus Tumor assoziierten Mikroglia und Makrophagen. Der CCR2/CCL2-Signalweg ist bekannt als relevanter Rekrutierungsweg für Makrophagen. Außerdem spielt er eine große Rolle im Rahmen des Tumorwachstums. In der vorliegenden Arbeit sollte der Einfluss der CCR2-Defizienz sowohl auf Mikroglia als auch auf Makrophagen durch Verwendung von Chimären zur Unterscheidung der beiden Populationen untersucht werden. Die Chimären wurden durch Kopfschutzbestrahlung und anschließender Knochenmarktransplantation von Wildtyp-(wt-) oder CCR2-Knockout-(CCR2ko-)Zellen generiert. Insgesamt erhielt man vier verschiedene Gruppen: wt/wt-, wt/ko-, ko/wt- und ko/ko-Gruppe, wobei der erste Teil des Ausdrucks den CCR2-Status der Mikrogliazellen und der zweite Teil den CCR2-Status der Makrophagen definiert. Dadurch wurden spezifische Untersuchungen der beiden Populationen in Abhängigkeit der CCR2-Defizienz ermöglicht. 21 Tage nach Implantation der syngenen Gliomzelllinie GL261 wurde die Tumorhemisphäre durchflusszytometrischen und immunfluoreszenz-basierten Messungen zugeführt. Tumorvolumina wurden magnetresonanztomographisch bestimmt. Des Weiteren wurden In-vitro-Versuche an isolierten Mikroglia und kultivierten Makrophagen durchgeführt. Die durchgeführten Experimente ergaben, dass die Rekrutierung von Makrophagen zum Hirntumor fast ausschließlich auf dem CCR2/CCL2-Signalweg beruhte, wohingegen Mikroglia in ihrer Migration durch einen CCR2ko weniger beeinträchtigt waren. In der wt/ko-Gruppe wanderten nahezu keine Makrophagen ein, währenddessen sich die Mikrogliaanzahl in dieser Gruppe erhöhte. Die Gesamtzahl an IBA1+-Zellen blieb konstant. In der ko/wt-Gruppe kam es zu einem analogen Phänomen mit reduzierter Mikroglia- und erhöhter Makrophagenanzahl. In der ko/ko-Gruppe waren die myeloiden Zellen zwar signifikant vermindert, die CCR2-Defizienz betraf aber vorrangig Makrophagen. FACS-Analysen ergaben, dass sich die Zusammensetzung der tumoraktivierten Zellpopulation, der CD45high-Fraktion, durch einen CCR2ko drastisch änderte. Das Fehlen des CCR2 führte zu einer Reduktion von CD45high-Mikroglia bzw. Makrophagen, die zusätzlich in der Expression von immunrelevanten Molekülen wie MHCII, CD86, Ly6C und TNFα eingeschränkt wurden. Eine Verminderung des CD45high-Anteils an allen CD11b+CD45+-Zellen konnte nur für die ko/ko-Gruppe festgestellt werden. Die Tumorvolumina unterschieden sich insgesamt nicht signifikant voneinander. In dieser Arbeit konnte der Effekt einer CCR2-Defizienz auf Mikroglia und Makrophagen sowie ihr gegenseitiger Einfluss näher beleuchtet werden. In erster Linie führt ein CCR2ko zu reduzierter Akkumulation der ko- sowie zu vermehrter Migration der wt-Zellpopulation. Die Gesamtzahl an myeloiden Zellen als auch der Anteil der CD45high-Fraktion verringert sich nur bei dualer Defizienz. Myeloide Zellen versuchen folglich, den fehlenden Counterpart auszugleichen. Die Bedeutung dessen kann bisher nicht abgeschätzt werden und sollte Gegenstand weiterer Untersuchungen sein.
Glioblastoma multiforme is the most frequent and most aggressive tumor amongst all malignant CNS tumors. Median overall survival is about one year after diagnosis. Notably, gliomas not only consist of tumor cells, but to a significant proportion of tumor associated microglia and macrophages. The CCR2/CCL2 signaling pathway is known as a relevant recruiting mechanism for macrophages and plays a pivotal role in glioma progression. In this study, we examined the impact of CCR2 deficiency on both microglia and macrophages using chimeric mice to differentiate between these cell types. Chimeras were generated by head protected irradiation and consecutive bone marrow transplantation of wildtype (wt) or CCR2 knockout (ko) cells. Four different groups were obtained: wt/wt, wt/ko, ko/wt and the ko/ko group, the first term indicating the CCR2 status of microglia, the second one those of macrophages. Thus, specific analyses of both populations (±CCR2ko) could be performed. 21 days after implantation of the syngeneic glioma cells GL261, tumor hemispheres were analyzed by flow cytometry and immunofluorescence staining. Tumor volumes were measured by MRI. Moreover, in vitro studies were conducted with isolated microglia and cultivated macrophages. Experiments revealed that recruitment of macrophages to the brain tumor relies almost exclusively on the CCR2/CCL2 signaling pathway, whereas microglia were less affected in migratory functions by CCR2 deficiency. Macrophages were barely found in the wt/ko group and microglia count increased simultaneously. Count of IBA1+ cells stayed constant. The ko/wt group showed analogous results with reduced microglia and increased macrophages. Overall count of myeloid cells in the ko/ko group was significantly diminished, particularly affecting macrophages. FACS analyses revealed an alteration of the tumor activated CD45high fraction based on CCR2 deficiency. Lack of CCR2 led to reduced CD45high microglia and macrophages, that are additionally restricted in expressing immunologically relevant molecules like MHCII, CD86, Ly6C and TNFα. Reduction of the CD45high fraction of all CD11b+CD45+ cells could only be found in the ko/ko group. Tumor volumes remained unchanged in all groups. In this study, the effect of CCR2 deficiency on both microglia and macrophages as well as their reciprocal effect was clearly demonstrated. Primarily, CCR2 deficiency leads to diminished accumulation of the CCR2ko cell population and at the same time to increased migration of the wt cell fraction. Reduced overall count of myeloid cells and reduction of CD45high fraction only occurs with dual deficiency. Consequently, myeloid cells try to counterbalance themselves, which should be the subject of further studies.
