This work deals with hydrogels based on linear bifunctional polyethylene glycol (PEG-BCN) and azide-functionalized hyperbranched polyglycerol (hPG-N3), which were crosslinked by the bioorthogonal strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. The hydrogel was immobilized onto different kind of surfaces, including glass slides, 96-well plates, cover slips, and Nunc NucleoLink stripes. The gels were linked to the surfaces by both covalent and adsorptive bonds. Common to all projects was the design of the hydrogel, which consisted of the two bioinert, hydrophilic, and tunable macromonomers PEG-BCN and hPG N3. Tuning the PEG length altered the mesh size, the mechanical properties, and the swelling behavior. Using the multivalent hPG allowed us to introduce further functions to the hydrogel, depending on the demands of the application. In the first project, we successfully investigated the hydrogel as a new biosensor matrix for the in situ, non-covalent entrapment of streptavidin and an antibody. We could show that the loading was drastically increased as compared to two-dimensional surfaces, the binding sites were still accessible, and small molecules (such as biotin and the FLAG peptide) would not stick to the gel unless their complementary binding partner was present. To detect a smaller oligonucleotide, however, it had to be anchored covalently to the hubs of the network. In a hybridization assay with fluorescence-labeled targets, the loading capacity was increased, and the sensitivity improved. This was attributed to the higher surface area of the hydrogel compared to flat surfaces, and to the better accessibility of each probe by the target due to the solution-like environment. Furthermore, the hydrogel-based biosensor was recovered for at least five cycles, and the hydrogel was stable against heat and against treatment with a strong base. The possibility of spotting the probe-containing hydrogel showed the potential for this method to be implemented in industrial applications. In the second project, our hydrogel was introduced into a microparticle-based planar multiplex assay. The hydrogel increased the multiplexicity by coding the microparticles not only in x,y-position but in x,y,k-position. The detection in k levels by a fluorescence microscope equipped with the VideoScan software created a novel three-dimensional assay format. Additionally, the hydrogel network formed a filter on the molecular level that controlled the pathways of differently sized target analytes into the respective levels. We were able to show that the sieve effect, i.e. the size exclusion, allowed us to separately detect oligonucleotides, Fab fragments, and entire IgG antibodies in a single assay. We not only investigated the assay performance but also characterized the hydrogel and its size-exclusion capability. We showed that the hydrogel was able to embed and immobilize fluorescent microparticles at different positions without disturbing the performance of the hybridization and immunoassay. Once the microparticles were set in the matrix they remained fixed during all assay procedures (incubation, washing, drying, etc.). Moreover, the whole system was subject to several circles of swelling and drying, during which the hydrogel managed to repeatedly separate two layers of microbeads. Encouraged by the diffusion behavior of the differently sized biomolecules, the third project aimed to develop a method for the simultaneous extraction of diffusivity and free-energy profiles of particles that permeate into our hydrogel system. Therefore, we studied the diffusion of five differently sized, fluorescence-labeled dextrans into two hydrogels with different PEG linker lengths. The fluorescence intensity data of the labeled dextrans, recorded using a standard confocal fluorescence microscopy setup, was sufficient for this approach. The numerical analysis of the experimental measurements provided a complete model of the penetration process. This allowed access to the dextran distribution over time across the entire bulk solution (which would not be accessible experimentally) and in the hydrogel, while at the same time extracting diffusion constants and partition coefficients. The results we obtained matched nicely with complementary fluorescence correlation spectroscopy (FCS) measurements and data from literature. From the partitioning of the dextran molecules we developed a free volume model that also accounts for the elastic flexibility of both the dextran and PEG polymers. We obtained an estimated mesh size, which indicated a heterogeneous gel structure involving a broad pore size distribution.
Diese Arbeit befasst sich mit Hydrogelen auf der Basis von linearem bifunktionellem Polyethylenglykol (PEG-BCN) und azidfunktionalisiertem, hyperverzweigtem Polyglycerin (hPG), die durch die bioorthogonale spannungsvermittelte Azid-Alkin-Cycloaddition (SPAAC, engl. Strain-promoted azide-alkyne cycloaddition) vernetzt wurden. Das Hydrogel wurde auf verschiedenen Arten von Oberflächen immobilisiert, darunter Glasobjektträger, 96-Well-Platten, Deckgläser und Nunc NucleoLink-Streifen. Die Gele waren sowohl durch kovalente als auch durch adsorptive Bindungen mit den Oberflächen verbunden. Allen Projekten gemeinsam war das Design des Hydrogels, das aus den beiden bioinerten, hydrophilen und modifizierbaren Makromonomeren bestand. Die Einstellung der PEG-Länge veränderte die Maschenweite, die mechanischen Eigenschaften und das Quellverhalten. Die Verwendung des multivalenten hPGs erlaubte es, dem Hydrogel je nach den Anforderungen der Anwendung weitere Funktionen zuzuführen. Im ersten Projekt wurde das Hydrogel erfolgreich als neue Biosensor-Matrix für den in situ, nicht-kovalenten Einschluss von Streptavidin und einem Antikörper eingesetzt. Wir konnten zeigen, dass die Beladung im Vergleich zu 2D-Oberflächen drastisch erhöht war, die Bindungsstellen noch zugänglich waren und kleine Moleküle (wie Biotin und das FLAG-Peptid) nicht am Gel haften blieben, wenn ihr komplementärer Bindungspartner nicht vorhanden war. Das kleinere Oligonukleotid musste jedoch kovalent an den Knotenpunkten des Netzwerks verankert werden. In einem Hybridisierungsassay mit fluoreszenzmarkierten Targets wurde die Beladungskapazität erhöht und die Sensitivität verbessert. Dies wurde zurückgeführt auf die größere Oberfläche des Hydrogels im Vergleich zu flachen Oberflächen und auf die bessere Zugänglichkeit jeder Sonde durch das Target aufgrund der lösungsähnlichen Umgebung. Darüber hinaus wurde der Biosensor auf Hydrogel-Basis mindestens über fünf Zyklen regeneriert, und das Hydrogel war gegen Hitze und Behandlung mit einer starken Base stabil. Die Möglichkeit, die Sonde zusammen mit dem Hydrogel zu spotten, zeigte das Potenzial, unser System auch in industriellem Kontext anzuwenden. Im zweiten Projekt wurde das Hydrogel in einen planaren Multiplex-Assay auf Mikropartikelbasis eingeführt. Das Hydrogel erhöhte die Multiplexität, indem es die Mikropartikel nicht nur in x,y-Position, sondern in x,y,k-Position kodierte. Die Detektion in k-Stufen durch ein Fluoreszenzmikroskop, das mit der VideoScan-Software ausgestattet war, schuf ein neuartiges 3-dimensionales Assay-Format. Zusätzlich bildete das Hydrogelnetzwerk einen Filter auf molekularer Ebene, der den Weg von unterschiedlich großen Zielanalyten in die jeweiligen Ebenen kontrollierte. Wir konnten zeigen, dass der Siebeffekt, d.h. der Größenausschluss, den getrennten Nachweis von Oligonukleotiden und Immunglobulinen (ganze Antikörper vom IgG-Typ) und Fab-Fragmenten in einem Assay ermöglichte. Wir untersuchten nicht nur die Leistungsfähigkeit des Assays, sondern charakterisierten auch das Hydrogel und seine Fähigkeit zum Größenausschluss. Wir zeigten, dass das Hydrogel in der Lage war, fluoreszierende Mikropartikel an verschiedenen Positionen einzubetten und zu immobilisieren, ohne die Leistung der Hybridisierung und des Immunoassays zu stören. Sobald die Mikropartikel in der Matrix fixiert waren, blieben sie während aller Testverfahren (Inkubation, Waschen, Trocknen usw.) fixiert. Darüber hinaus wurde das gesamte System während mehrerer Zyklen gequollen und getrocknet, wobei es dem Hydrogel gelang, zwei Schichten von Mikrobeads wiederholt zu trennen. Angeregt durch das Diffusionsverhalten der Biomoleküle unterschiedlicher Größe zielte das dritte Projekt darauf ab, eine Methode zur gleichzeitigen Extraktion von Diffusivitäts- und freien Energieprofilen von Partikeln zu entwickeln, die in unser Hydrogelsystem eindringen. Dafür wurde die Diffusion von fünf unterschiedlich großen, fluoreszenzmarkierten Dextranen in zwei Hydrogele mit unterschiedlichen PEG-Linkerlängen untersucht. Die Fluoreszenzintensitätsdaten der markierten Dextrane, die mit einem konfokalen Standard-Fluoreszenzmikroskopie-Setup aufgezeichnet wurden, waren für diese Anforderungen ausreichend. Die numerische Analyse der experimentellen Messungen lieferte ein vollständiges Modell des Penetrationsprozesses. Dies ermöglichte den Zugriff auf die zeitliche Verteilung von Dextran über die gesamte Bulklösung (die experimentell nicht zugänglich wäre) und im Hydrogel, während gleichzeitig Diffusionskonstanten und Verteilungskoeffizienten extrahiert wurden. Die erhaltenen Ergebnisse stimmten gut mit Messungen der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) und Daten aus der Literatur überein. Aus der Partitionierung der Dextranmoleküle entwickelten wir ein Freies-Volumenmodell, das auch die elastische Flexibilität sowohl der Dextran- als auch der PEG-Polymere berücksichtigt. Wir erhielten eine geschätzte Maschengröße, die auf eine heterogene Gelstruktur mit einer breiten Porengrößenverteilung hinwies.
