Relapse of acute lymphoblastic leukemia is a major cause of death in childhood cancer. Activating mutations in the cytosolic 5´-nucleotidase II (NT5C2) are considered to drive relapse formation in acute lymphoblastic leukemia (ALL) by conferring purine analogue resistance. NT5C2 mutations are found in 20% of relapses of pediatric T-ALL and in 3-45% of relapses of the more frequent B-cell precursor ALL. To examine the clinical effects of NT5C2 mutations in relapsed ALL, we analyzed NT5C2 in 455 relapsed B-cell precursor ALL patients treated within the ALL-REZ BFM 2002 relapse trial using sequencing and sensitive allele-specific real-time PCR. We detected 105 NT5C2 mutations in 74 (16%) of 455 patients with B-cell precursor ALL relapse. Mutation hot spots were p.R39Q and p.R367Q. Two-thirds of relapses harboured subclonal and only one third clonal mutations. NT5C2 mutations rarely occurred in relapses with ETV6/RUNX1 fusion gene (p=0.001), but were frequent in relapses of so-called B-other-ALL (p<0.001). Surprisingly, both subclonal and cloncal NT5C2 mutations were associated with inferior event-free survival compared to wild-type (19% and 25% vs 53%, p<0.001). Clonal NT5C2 mutations were highly associated with an increased cumulative incidence of second relapse (clonal 56%, subclonal 41%, wild-type 28.8%, p=0.002). Relapses with subclonal NT5C2 mutations showed an increased rate of nonresponse (subclonal 33%, clonal 9%, wild type 9%, p<0.001) and 80% of those patients who responded to relapse treatment presented with high minimal residual disease levels at the end of relapse induction treatment. However, subclonal, but not clonal NT5C2 mutations were associated with reduced event-free survival in multivariable analysis (HR 1.89 [95% CI 1.28-2.69], p=0.001). To investigate whether outgrowth of NT5C2 mutant subclones during relapse treatment contributes to the poor patient response and outcome, we analyzed follow-up samples and found that subclonal NT5C2 mutations never grew out to clonal mutations at the time of nonresponse or second relapse. In fact, 82% of subclonal NT5C2 mutations became undetectable at the time of nonresponse or second relapse, and in 71% patients subclonal NT5C2 mutations were undetectable already after relapse induction treatment. These results show that subclonal NT5C2 mutations define relapses associated with high risk of treatment failure and at the same time emphasize that their role in outcome is complex and goes beyond mutant NT5C2 acting as a targetable driver during relapse progression. Sensitive, prospective identification of NT5C2 mutations is warranted to improve the understanding and treatment of this aggressive ALL relapse subtype.
Kinder mit Rezidiv einer akuten lymphoblastischen Leukämie (ALL) werden mit einer intensiven Zweitlinien-Chemotherapie behandelt, dennoch zeigen rezidivierte Leukämien häufig Resistenzen. Aktivierende Mutationen im NT5C2 (cytosolic 5´-nucleotidase II) Gen wurden beschrieben eine Resistenz gegen Purin Analoga zu verursachen und somit das Auswachsen des ALL-Rezidives zu unterstützen. Mutationen in NT5C2 wurden in 20% bei T-ALL-Rezidiven und 3-45% bei B-Zell Vorläufer ALL-Rezidiven identifiziert. Um die klinischen Auswirkungen von NT5C2 Mutationen zu untersuchen, analysierten wir NT5C2 in 455 B-Zell Vorläufer ALL-Rezidiven von pädiatrischen Patienten, welche nach der ALL-REZ BFM 2002 Rezidivtherapie behandelt worden waren, mittels Sequenzierung und sensitiver allelspezifischer Echtzeit-PCR. Insgesamt identifizierten wir 110 Mutationen in 75 (16,5%) von 455 ALL-Rezidiv Patienten. Die häufigsten Mutationen waren p.R39Q und p.R367Q. Zwei Drittel aller Mutationen waren subklonal in unter 15% der Leukämiezellen vorhanden und nur ein Drittel hauptklonal. Mutationen in NT5C2 traten selten zusammen mit dem Fusionsgen ETV6/RUNX1 (p=0.001), jedoch häufig in der Gruppe ohne etablierte zytogenetische Veränderungen, der sogenannten B-other ALL, auf (p=0.001). Patienten mit einem B-Zell ALL-Rezidiv mit subklonalen sowie hauptklonalen NT5C2 Mutationen hatten ein signifikant schlechteres ereignisfreies Überleben als Patienten mit wildtypischem NT5C2 (19% und 25% versus 53%, p<0.001). Allerdings waren nur subklonale, aber nicht hauptklonale NT5C2 Mutationen in der multivariablen Analyse unabhängig mit verringertem ereignisfreiem Überleben assoziiert (HR 1.89 [95% CI 1.28-2.69], p=0.001). Zudem hatte die Patientengruppe mit ALL-Rezidiv mit subklonalen NT5C2 Mutationen eine erhöhte Rate an Fällen, die nicht auf die Rezidivtherapie ansprachen (engl. nonresponse) (subklonal 33%, hauptklonal 9%, Wildtyp 9%, p<0.001). Patienten mit subklonalen NT5C2 Mutationen, welche auf die Rezidivtherapie ansprachen, hatten in 80% der Fälle erhöhte Level von minimaler Resterkrankung nach der Zweitlinien-Induktionsbehandlung. Um zu untersuchen, ob subklonale NT5C2 Mutationen während der Rezidivtherapie auswachsen und das schlechte Ansprechen auf die Rezidivtherapie verursachen, untersuchten wir Proben, die im Verlauf sowie nach der Rezidivtherapie entnommen wurden. Tatsächlich wuchsen subklonale NT5C2 Mutationen nie zu einer hauptklonalen Mutation aus, und 27 von 33 (82%) subklonalen Mutationen waren zum Zeitpunkt der Nonresponse oder des zweiten Rezidivs nicht mehr zu detektieren. In 10 von 14 Patienten konnte die subklonale NT5C2 Mutation bereits nach der Zweitlinien-Induktionsbehandlung nicht mehr detektiert werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass subklonale NT5C2 Mutationen Rezidive definieren, welche mit einem hohen Risiko des Therapieversagens nach dem Rezidiv assoziiert sind. Zudem weisen sie darauf hin, dass die Rolle der subklonalen Mutationen bei der Progression des ALL-Rezidivs komplex ist und über NT5C2 als einzelnen Verursacher hinausgeht.
