Human papilloma virus (HPV), which belongs to the most common sexually transmitted human pathogens, is linked to several cancers including cervical and oropharyngeal cancer. The most important HPV genotypes in this respect are HPV16 and HPV18. Expression of the highly conserved HPV-encoded E6 and E7 oncoproteins is required for the initiation and progression of HPV-associated malignancies. So far, no approved therapeutic vaccine against HPV-associated cancer is available. Another important type of cancer is glioblastoma multiforme (GBM), the most aggressive primary brain tumor. GBM patients have a very short median survival time despite standard treatment involving surgery, chemotherapy, and radiation. Thus, novel therapeutic strategies are urgently needed to improve the poor prognosis of GBM patients. The aim of this study was to develop a human cytomegalovirus (HCMV)-based platform for generation of therapeutic vaccines against cancer. Malignant cells are killed by cytotoxic CD8+ T lymphocytes (CTLs) that recognize tumor neoantigens presented by MHC class I molecules (MHC-I). Thus, therapeutic cancer vaccines should induce a high frequency of CTLs that can recognize tumor neoantigens. In this regard, HCMV is a very promising starting point for a vaccine platform. HCMV, a member of the β-herpesvirinae affecting 60-80% of the population in the developed countries, causes latent asymptomatic infection in immunocompetent individuals. The persistent HCMV infection is associated with a uniquely high frequency of HCMV-specific CTLs with an effector-memory phenotype representing 10-20% of all circulating T cells, a phenomenon called memory inflation. Accordingly, a tumor neoantigen vectored by HCMV should induce strong antitumor responses. As a proof of principle, we developed a HCMV based therapeutic vaccine that can induce CTLs recognizing HPV16-encoded E6 as a neoantigen. Intriguingly, these HCMV-based vaccines can also infect GBM cells. This finding paves the way for altering the immunogenicity of GBM by driving the presentation of E6 as a neoantigen, thus rendering GBM susceptible to CTL attack, e.g. after adoptive transfer of E6-specific autologous T cells. In order to optimize antigen presentation to CTLs, HCMV-encoded MHC-I downregulating genes (US2-US11) were deleted in the HCMV vector. This modified vector was used to express a non-transforming HPV16 E6/E7 fusion protein that covers all the relevant antigenic peptides. Further HCMV modifications such as insertion of exogenous promoter or interruption of additional immune evasion genes (such as UL111A) were introduced to optimize the CTL response. In addition, different types of HCMV-based vaccine candidates were constructed by linking a dominant antigenic peptide derived from HPV16 E6 to HCMV proteins. Surprisingly, only the latter could efficiently stimulate E6 peptide-specific T cells. To explore the mechanism that interferes with processing and presentation of the HPV16 E6/E7 fusion protein, cells were stably transfected with a plasmid expressing the HPV16 E6/E7 fusion protein. Intriguingly, these E6/E7 expressing cells were able to stimulate E6 specific T cells in the absence of HCMV. However, this stimulation was significantly inhibited when E6/E7-expressing cells were additionally infected with HCMV, although the HCMV used no longer possessed any MHC-I-downregulating genes. This finding shows a novel HCMV-encoded block of MHC-I antigen presentation that is independent of the already known MHC-I downregulating HCMV genes. This is the first study describing the construction of HCMV-based vaccines expressing tumor neoepitopes and provides the preclinical basis for development of HCMV-based therapeutic vaccines against cancers. Further investigations using different cell lines in vitro as well as in vivo studies exploring the safety and therapeutic effect of HCMV-based vaccines are warranted.
Das humane Papillomvirus (HPV), welches zu den häufigsten sexuell übertragbaren menschlichen Krankheitserreger gehört, ist mit verschiedenen Krebsarten einschließlich Cervixkarzinom und Oropharynxkarzinom assoziiert. Die wichtigsten HPV-Genotypen in dieser Hinsicht sind HPV16 und HPV18. Die Expression der hochkonservierten HPV-kodierten E6- und E7-Onkoproteine ist für die Initiierung und das Fortschreiten von HPV-assoziierten Malignomen erforderlich. Bislang ist kein zugelassener therapeutischer Impfstoff gegen HPV-assoziierten Krebs verfügbar. Eine weitere wichtige Krebsart ist das Glioblastoma multiforme (GBM), der aggressivste primäre Hirntumor. GBM-Patienten haben trotz der Standardbehandlung mit Operation, Chemotherapie und Bestrahlung eine sehr kurze mediane Überlebenszeit. Daher werden dringend neue therapeutische Strategien benötigt, um die schlechte Prognose von GBM-Patienten zu verbessern. Das Ziel dieser Studie war die Entwicklung einer auf dem humanen Cytomegalievirus (HCMV) basierenden Plattform für die Herstellung therapeutischer Impfstoffe gegen Krebs. Bösartige Zellen werden von zytotoxischen CD8+ T-Lymphozyten (CTLs), die von MHC-Klasse-I-Molekülen (MHC-I) präsentierte Tumor-Neoantigene erkennen, abgetötet. Daher sollten therapeutische Krebsimpfstoffe eine hohe Frequenz von CTLs induzieren, die Tumor-Neoantigene erkennen können. In dieser Hinsicht ist das HCMV ein sehr vielversprechender Ausgangspunkt für eine Impfstoffplattform. HCMV, ein Mitglied der β-Herpesvirinae, das 60-80% der Bevölkerung in den entwickelten Ländern betrifft, verursacht eine latente asymptomatische Infektion bei immunkompetenten Personen. Die persistierende HCMV-Infektion ist mit einer einzigartig hohen Frequenz von HCMV-spezifischen CTLs mit einem Effektor-Gedächtnis-Phänotyp verbunden, der 10-20% aller zirkulierenden T-Zellen ausmacht, ein Phänomen, das als „Memory inflation“ bezeichnet wird. Dementsprechend sollte ein durch HCMV exprimiertes Tumor-Neoantigen starke Immunreaktionen gegen den Tumor auslösen. Als „Proof of principle“ haben wir einen therapeutischen Impfstoff auf der Basis von HCMV entwickelt, der CTLs induzieren kann, die HPV16-kodiertes E6 als Neoantigen erkennen. Interessanterweise können diese Impfstoffe auf HCMV-Basis auch GBM-Zellen infizieren. Diese Erkenntnis ebnet den Weg für eine Veränderung der Immunogenität von GBM, indem sie die Präsentation von E6 als Neoantigen ermöglicht und damit GBM anfällig für einen CTL-Angriff macht, z.B. nach adoptivem Transfer von E6-spezifischen autologen T-Zellen. Um die Antigenpräsentation für CTLs zu optimieren, wurden HCMV-kodierte MHC-I herunterregulierende Gene (US2-US11) im HCMV-Vektor deletiert. Dieser modifizierte Vektor wurde zur Expression eines nicht-transformierenden HPV16 E6/E7-Fusionsproteins verwendet, das alle relevanten antigenen Peptide abdeckt. Weitere HCMV-Modifikationen wie die Einfügung eines exogenen Promotors oder die Unterbrechung zusätzlicher Immunevasionsgene (wie UL111A) wurden eingeführt, um die CTL-Antwort zu optimieren. Darüber hinaus wurden andere Impfstoffkandidaten auf HCMV-Basis konstruiert, die ein dominantes antigenes Peptid des HPV E6 Proteins verknüpft mit HCMV-Proteinen exprimieren. Überraschenderweise weise konnten nur letztere effizient E6-Peptid-spezifische T-Zellen stimulieren. Um den Mechanismus zu untersuchen, der die Prozessierung und Präsentation des HPV16 E6/E7-Fusionsproteins stört, wurden Zellen stabil mit einem Plasmid transfiziert, welches das HPV16 E6/E7-Fusionsprotein exprimiert. Interessanterweise konnten diese E6/E7-exprimierenden Zellen E6-spezifische T-Zellen stimulieren – in Abwesenheit von HCMV. Diese Stimulation wurde jedoch bei einer zusätzlichen Infektion E6/E7-exprimierenden Zellen mit HCMV signifikant gehemmt, obwohl das verwendete HCMV keine MHCI-herunterregulierenden Genen mehr besaß. Dieser Befund zeigt einen neuartigen HCMV-kodierten Block der MHC-I-Antigenpräsentation, der unabhängig von den bereits bekannten MHC-I herunterregulierenden HCMV-Genen ist. Dies ist die erste Studie, welche die Herstellung von Tumor-Neoepitop exprimierenden HCMV-basierten Impfstoffen beschreibt. Sie ist damit die präklinische Grundlage für die Entwicklung von therapeutischen Impfstoffen gegen Krebs auf HCMV-Basis. Weitere Untersuchungen mit verschiedenen Zelllinien in vitro und in vivo, die die Sicherheit und die therapeutische Wirkung von Impfstoffen auf HCMV-Basis untersuchen, sind gerechtfertigt.
