Die Alzheimer Demenz (AD), eine neurodegenerative Erkrankung vor allem des älteren Menschen, ist verantwortlich für mindestens 60 % aller Demenzen. Dennoch ist eine frühe Diagnose nach wie vor schwierig zu stellen, insbesondere in Abgrenzung zu anderen neurodegenerativen Erkrankungen. MicroRNAs (miRNAs) sind ca. 22 Nukleotide lange, nicht-kodierende, einzelsträngige RNAs, die an der post-transkriptionellen Genexpression beteiligt sind. Die miRNA-Familie let-7 ist stark im Gehirn exprimiert und umfasst neun miRNAs mit ähnlicher Sequenz, let-7a, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f, let-7g, let-7i und miR-98. Alle let-7-miRNAs verfügen über ein GU-reiches Motiv, über das sie als endogene Signalmoleküle den Toll-like-Rezeptor (TLR) 7 stimulieren können, was in Mikroglia und Neuronen zu Neuroinflammation und -degeneration führt. In dieser Arbeit sollte mittels quantitativer Echt-Zeit-Polymerase-Ketten-Reaktion (qRTPCR) die Expression von let-7-miRNAs in humanem Liquor von Patienten mit AD sowie von Patienten mit FTD, Depression, klinisch isoliertem Syndrom (CIS) und gesunden Individuen, die als Vergleichskontrollgruppe dienten, quantifiziert werden. In Hinblick auf ihre extrazelluläre Stabilität wurde eine Assoziation von let-7-miRNAs mit Exosomen im Liquor von AD-Patienten mit Hilfe von qRT-PCR und Western-Blot geprüft. Ob und in welchem Ausmaß Mitglieder der let-7-miRNA-Familie neurotoxisch wirken können, wurde zudem an primären murinen Neuronen sowie einer murinen und einer humanen Zelllinie untersucht und nach immunozytochemischer NeuN- sowie nach TUNEL-Färbung beurteilt. Let-7a-, let-7b-, let-7c-, let-7d-, let-7e-, let-7f-, let-7g- und let-7i-miRNAs konnten im Gegensatz zu miR-98 sowohl im Liquor von Patienten mit AD als auch mit FTD, Depression und CIS sowie im Liquor von gesunden Kontrollpatienten detektiert werden. Die Kopienzahlen der miRNAs let-7b und let-7e waren im Liquor von AD-Patienten verglichen mit der Kontrollgruppe erhöht. Let-7b-Kopienzahlen waren außerdem erhöht in Liquores von Patienten mit Depression und let-7e-Kopienzahlen im Liquor von Patienten mit Depression und von Patienten mit CIS. Die übrigen getesteten let-7-miRNAs wiesen keine Unterschiede zwischen den Gruppen auf. Let-7e und let-7b waren auch nach langer Lagerung noch im Liquor von Patienten mit AD nachweisbar und lagen im AD-Liquor außerdem vollständig mit Exosomen assoziiert vor. Alle untersuchten Mitglieder der let-7-Familie zeigten an primären Neuronenkulturen – in unterschiedlicher Ausprägung – neurotoxische Effekte im Sinne morphologischer Zellschädigung sowie gesteigerter Apoptose. Die Anwesenheit von nicht-neuronalen Zellen wie Mikroglia war dabei nicht notwendig, denn nach Stimulation neuronaler Zelllinien wurde ein ebenso ausgeprägter neuronaler Zelltod beobachtet. Insgesamt wurde gezeigt, dass spezifische Mitglieder der miRNA-Familie let-7 neuronale Apoptose in vitro induzieren. Des Weiteren waren Mitglieder der let-7-miRNA-Familie in humanem Liquor nachweisbar. Let-7b- und let-7e-Kopien waren selektiv im Liquor von Patienten mit AD und Depression beziehungsweise von Patienten mit AD, Depression und CIS verglichen mit der Kontrollgruppe erhöht. Im Liquor von Patienten mit AD waren diese miRNAs an Exosomen gebunden, was ihre extrazelluläre Stabilität erklären könnte. Die selektive Expression von let-7-miRNAs im Liquor von Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen, ihre Stabilität und ihre nachgewiesene Neurotoxizität könnten unser Verständnis der Pathomechanismen neurodegenerativer Erkrankungen vertiefen und machen let-7-miRNAs zu potentiellen Biomarkern für Diagnose und Beurteilung spezifischer neurodegenerativer Erkrankungen wie AD.
AD is a neurodegenerative disease of the elderly and responsible for at least of 60 % of all forms of dementia. Nevertheless, early diagnosis continues to be challenging, in particular when differentiated from other neurodegenerative diseases. MiRNAs are 22 nucleotides long, noncoding single-stranded RNAs involved in the posttranscriptional regulation of gene expression. The miRNA-family let-7 is expressed abundantly in the brain and comprises 9 members, let-7a, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f, let-7g, let-7i and miR-98 that share a similar sequence. All let-7 miRNAs have a GU-rich motif in common by which they can act as endogenous signalling molecules for TLR7 and lead to neuroinflammation and -degeneration in microglia and neurons. Here, expression of let-7 miRNAs in human cerebrospinal fluid (CSF) of patients with neurodegenerative diseases and healthy control individuals should be quantified and analysed comparatively by qRT-PCR. The question of if, and to what extent members of the let-7 family mediate neurotoxicity was analysed in primary cortical neurons as well as in a murine and a human neuronal cell line using immunostaining and TUNEL-assay. Let-7 miRNAs could be detected in the CSF of patients with AD, FTD, Major depressive Episode (MDE) and CIS as well as in the control individuals. However, the amount of individual let-7 miRNAs in the CSF varied substantially. CSF from patients with AD contained higher amounts of let-7b and let-7e compared to healthy controls. No increase in let-7b and let-7e copy numbers was detected in CSF from patients with FTD, whereas copy levels of let-7b were elevated in CSF from patients with depression. Additionally, copy levels of let-7e were elevated in CSF from patients with depression and from patients with CIS. No differences were observed with regards to the other let-7 miRNAs. Detection of let-7b and let-7e in the CSF of patients with AD was still possible after a long storage time. Besides, in CSF of patients with AD, let-7b and let-7e were exclusively associated with exosomes. In primary cortical neurons all let-7 family members that were tested mediated neurotoxicity with morphological cell damage and increased apoptosis. Presence of non-neuronal cells like microglia was not necessary, given that stimulation of neuronal cell lines led to a similar degree of cell death. Selective expression of let-7 miRNAs in CSF of patients with neurodegenerative diseases and their demonstrated neurotoxicity could further help to understand the pathology of neurodegenerative diseases. Thus, let-7 miRNAs are potential biomarkers for diagnosis and evaluation of specific neurodegenerative diseases like AD.
