Signal transducers and activators of transcription (STAT) are a family of proteins that regulate gene transcription. Seven members (STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6) have been identified in human STAT family since two decades ago. As a member of the STAT family, STAT5 plays a central role in transmitting signals from transmembrane receptors such as cytokine receptors and growth factor receptors to the nucleus. It has been found that STAT5 is constitutively phosphorylated at a conserved tyrosine residue located at the end of SH2 domain by various activated tyrosine kinases in a broad range of human cancer cells. Inhibiting STAT5 has been considered as a promising approach for cancer therapy. However, STATs have been described as difficult pharmacological targets and small-molecule inhibitors of STAT5 are poorly investigated. The subject of this work is the investigation of small-molecule inhibitors targeting STAT5b-SH2. The tetrazole-containing active compounds discovered in this work are derived from the furazan-based phosphate mimetics. In the first section of this work, a structurally stable scaffold was designed. The aim is to improve the binding affinity of the existing inhibitors and to avoid the instability. For this purpose, four different methods were tried to synthesize the new structures. The main problem, low reactivity of the amino group in fragment 1 in the formation of a linkage between the furazan ring and the 5-position in the tetrazole ring, was solved in the N-cyanomethyl amine synthetic method. The obtained compounds showed expected stability under acidic conditions. However, these compounds were surprisingly inactive in a FP binding assay. In the second section of this work, a series of 1-aminomethyl tetrazoles based on the structures with different substituents at the 5-position of the tetrazole ring was synthesized via Mannich ligation reaction. Most of them displayed binding affinity to STAT5b-SH2 in low micromolar range in the FP-based competitive binding assay, in which compound 24 was the most active one with a Ki value of 1.8 µM. To investigate how different substituents at the 5-position of the tetrazole ring influence the stability of the scaffold, a systematic stability analysis was carried out on LC-MS and compounds 19, 22, 24, and 25 were found to possess better stability in contrast with the lead compounds 2 and 3. Furthermore, the binding of compound 24 to STAT5b-SH2 and the pivotal role of Asn642 were proven in the binding assays. Finally, the inhibitory activity of compounds 3 and 24 on leukemic cell proliferation was determined by the Alamar Blue assay.
STAT (signal transducers and activators of transcription) sind eine Familie von Proteinen, die die Gentranskription regulieren. Sieben Mitglieder (STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6) wurden vor zwei Jahrzehnten in der menschlichen STAT-Familie identifiziert. Als Mitglied der STAT-Familie spielt STAT5 eine zentrale Rolle bei der Übertragung von Signalen von Transmembranrezeptoren wie Zytokinrezeptoren und Wachstumsfaktorrezeptoren zum Zellkern. Es wurde gefunden, dass STAT5 an einem konservierten Tyrosinrest, der sich am Ende der SH2-Domäne befindet, durch verschiedene aktivierte Tyrosinkinasen in einem breiten Bereich menschlicher Krebszellen konstitutiv phosphoryliert wird. Die Hemmung von STAT5 gilt als vielversprechender Ansatz für die Krebstherapie. STAT-Proteine wurden jedoch als schwierige pharmakologische Ziele beschrieben, und niedermolekulare Inhibitoren von STAT5 sind nur unzureichend untersucht. Gegenstand dieser Arbeit ist die Untersuchung von niedermolekularen Inhibitoren, die auf STAT5b-SH2 abzielen. Die in dieser Arbeit entdeckten Tetrazol-haltigen Verbindungen leiten sich von den Furazan-basierten Phosphat-Mimetika ab. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde ein strukturelles stabiles Gerüst entworfen. Ziel ist es, die Bindungsaffinität der vorhandenen Inhibitoren zu verbessern und die Instabilität zu vermeiden. Zu diesem Zweck wurden vier verschiedene Methoden zur Synthese der neuen Strukturen ausprobiert. Das Hauptproblem, die geringe Reaktivität der Aminogruppe in Fragment 1 bei der Bildung einer Bindung zwischen dem Furazanring und der 5-Position im Tetrazolring, wurde mit der N-Cyanomethylamin-Synthesemethode gelöst. Die erhaltenen Verbindungen zeigten erwartete Stabilität unter sauren Bedingungen. Diese Verbindungen waren jedoch in einem FP-Bindungsassay überraschend inaktiv. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine Reihe von 1-Aminomethyltetrazolen basierend auf den Strukturen mit unterschiedlichen Substituenten an der 5-Position des Tetrazolrings durch Mannich-Ligation synthetisiert. Die meisten von ihnen zeigten im FP-basierten kompetitiven Bindungstest, in dem Verbindung 24 die aktivste Verbindung mit einem Ki-Wert von 1,8 µM war, eine Bindungsaffinität zu STAT5b-SH2 im niedrigen mikromolaren Bereich. Um zu untersuchen, wie unterschiedliche Substituenten an der 5-Position des Tetrazolrings die Stabilität des Gerüsts beeinflussen, wurde eine systematische Stabilitätsanalyse an LC-MS durchgeführt und festgestellt, dass die Verbindungen 19, 22, 24 und 25 im Gegensatz dazu eine bessere Stabilität aufweisen mit den Bleiverbindungen 2 und 3. Weiterhin wurden die Bindung von Verbindung 24 an STAT5b-SH2 und die Schlüsselrolle von Asn642 in den Bindungsassays nachgewiesen. Schließlich wurde die Hemmwirkung der Verbindungen 3 und 24 auf die Leukämiezellproliferation durch den Alamar Blue-Assay bestimmt.
