The adaptive immune system as part of the human immune system provides defense against invading pathogens and provides a highly specific immunological memory. One of the main effector cells of the adaptive immune system are the T-lymphocytes. Antigen recognition of pathogens by this cell type is mediated through antigen-specific receptors located on the lymphocyte surface. The high diversity of these receptors, which is required for a broad range of antigen recognition, is achieved by rearrangements of the variable (V), diversity (D) and joining (J) gene segments of the T-cell receptor (TCR) genes resulting in a de novo sequence that can be seen as a fingerprint of each individual T cell. T-cell disorders such as lymphomas or mature T-cell leukemias originate from a single malignant transformed T-lymphoid cell. Thereby, all malignant T cells derived from one precursor cell and share the identical TCR rearrangement. Molecular analyses of multiplex PCR generated TCR sequences are frequently used to distinguish between such clonal cell populations of T-cell malignancies and non-clonal cell proliferations without existing lymphoma. Within the advent of high-throughput sequencing (HTS), the composition of TCR repertoires can now be analyzed in an unprecedented depth which enables new insights into the role of T cells in the immune system. In this thesis a combined multiplex T-cell receptor beta (TCRβ) PCR and HTS approach was established to analyze TCRβ repertoires of two T-cell related topics to elucidate i) the importance of the TCRβ repertoire of donors in allogeneic stem cell transplantation and ii) the origin of double negative T cells (DNTS) in patients suffering from the autoimmune lymphoproliferative syndrome (ALPS). Analyses of i) revealed that the diversity of the donor derived TCR repertoire plays a decisive role for a successful transplantation and influences significantly the clinical course regarding reactivation of Epstein-Barr virus (EBV) and Cytomegalovirus (CMV) in the recipient. Whereas analyses and tracking of ii) the TCRβ repertoire in an ALPS patient indicated for the first time that DNTs can also originate from the CD4+ T-cell compartment and not exclusively from CD8+ T-cells. Taken together, the successfully established approach for TCRβ repertoire analysis by massive parallel sequencing of TCRβ amplicons after multiplex PCR is suitable for the determination of T-cell repertoire diversity as well as tracking of individual T-cell rearrangements. It can be used in a broad field of clinical applications and might support clinical diagnostics or treatment decisions for patients suffering from T-cell malignancies.
Das adaptive Immunsystem, welches einen Teil des menschlichen Immunsystems bildet, dient der Abwehr von eindringenden Pathogenen und bildet ein hochspezifisches immunologisches Gedächtnis aus. Eine der Haupteffektorzellen des adaptiven Immunsystems sind die T-Lymphozyten. Dieser Zelltyp erkennt pathogene Antigene über antigen-spezifische Rezeptoren auf seiner Zelloberfläche. Die enorme Diversität dieser Rezeptoren, die für eine breite Antigenerkennung benötigt wird, wird über die Umlagerung der variablen (V), diversitäts (D) sowie verbindenden (joining - J) Gensegmente des T-Zellrezeptors (TCR) ausgebildet. Die daraus resultierende de novo Sequenz kann als Fingerabdruck für die individuelle T-Zelle angesehen werden. T-Zellerkrankungen wie Lymphome oder Leukämien entstehen aus einer einzelnen transformierten T-Lymphozytenzelle. Dabei können alle malignen Zellen von einer Vorläuferzelle abgeleitet werden und weisen dementsprechend eine identische TCR Umlagerung auf. Molekulare Analysen von multiplex PCR generierten TCR Sequenzen werden daher häufig verwendet, um zwischen solchen klonalen Zellpopulationen in T-Zellerkrankungen und nicht klonaler Zellproliferation ohne Lymphomanteil zu unterscheiden. Mit dem Aufkommen von Hochdurchsatz-Sequenziermethoden (HTS) ist es nun möglich das TCR Repertoire in einem bisher nicht möglichen Umfang zu sequenzieren, welches neue Einblicke in die Rolle der T-Zellen im Immunsystem ermöglicht. In der vorliegenden Arbeit wurde ein kombinierter Multiplex-PCR HTS Ansatz etabliert, mit dem das T-Zellrezeptor beta (TCRβ) Repertoire für die folgenden zwei T-Zell bezogenen Themenbereiche erfasst werden sollte, um i) die Bedeutung des TCRβ Repertoires von Spendern bei allogener Stammzelltransplantation sowie ii) den Ursprung doppelt negativer T-Zellen (DNTs) in Patienten mit Autoimmun- lymphoproliferativen Syndrom (ALPS) zu klären. Unter i) durchgeführte Analysen zeigten, dass die Diversität des TCR Repertoires im Spender eine entscheidende Rolle für eine erfolgreiche Transplantation einnimmt und diese signifikant den klinischen Verlauf in Bezug auf die Reaktivierung des Epstein-Barr Virus (EBV) und des Cytomegalievirus (CMV) im Empfänger beeinflusst. Hingegen brachten Analyse und Tracking des TCRβ Repertoires in einem ALPS Patienten unter ii) zum ersten Mal Hinweise darauf, dass DNTs sich ebenso aus CD4+ T-Zellen und nicht ausschließlich aus CD8+ T-Zellen entwickeln können. Abschließend lässt sich festhalten, dass unsere erfolgreich etablierte Methode zur TCRβ Analyse mittels umfangreicher paralleler Sequenzierung von TCRβ Amplifikaten nach multiplex PCR für die Erhebung der Diversität des T-Zellrepertoires sowie zum Tracking von individuellen T-Zellumlagerungen geeignet ist. Damit kann diese Methode in einem umfangreichen Bereich bei klinischen Fragestellungen Anwendung finden und zur Unterstützung der klinischen Diagnostik sowie als Entscheidungshilfe für die Therapie von malignen T-Zellerkrankungen eingesetzt werden.
