Background: The unfavorable prognosis for locally advanced and metastatic head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is primarily due to the resistance of cancer stem cells (CSCs) to radio-chemotherapy. ALDH (Aldehyde Dehydrogenase) has been used as a marker to identify CSCs in several tumors including HNSCC. Disulfiram (DSF) is a pan-ALDH inhibitor, which has been found to have remarkable anti-cancer activity. Moreover, DSF is a strong bivalent metal ion chelator, which binds copper (Cu2+) and is responsible for enhanced cytotoxicity. Methods: Cell viability was assessed using proliferation and apoptosis assays. A synergistic effect was defined by calculating the combination index (CI). ALDH activity was determined by ALDELUOR assay. Stemness-related transcription factors (TFs) were detected by qRT-PCR (Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction), and cellular self-renewal was measured by sphere- and colony-formation. Migration ability was performed by wound healing assay. Cell cycle and Reactive Oxygen Species (ROS) activity were analyzed by flow cytometry. Results: Our results showed a strong anti-proliferative effect of DSF in a dose- and time-dependent manner, and Cu2+ addition dramatically enhanced cytotoxicity. DSF or DSF/Cu2+ significantly reduced the proportion of ALDH high CSCs (e.g. from 59.8% to 33% and 30.0% in UM-SCC9) and stemness-related TFs. They reduced colony formation (e.g. from 145 to 72 and 70 in UM-SCC9), spheroid formation (e.g. from 39 to 18 and 20 in UM-SCC9), and migration ability (e.g. from 71.85% to 42.1% and 43.49% in UM-SCC9). DSF or DSF/Cu2+ induced ROS generation and triggered cellular apoptosis. DSF or DSF/Cu2+ abolished the cisplatin-induced cell cycle G2/M phase arrest (e.g. from 52.9% to 41.2% and 42.2% in UM-SCC9), overcame the resistance of cisplatin in ALDH high cells, and showed a synergistic effect in combination with cisplatin (CI<1). Combining radiation (IR) with DSF or DSF/Cu2+ showed a growth inhibition and attenuated the cell cycle G2/M phase arrest (e.g. from 53.6% to 40.2% and 41.9% in UM-SCC9). Moreover, the triple treatment with DSF or DSF/Cu2+, cisplatin, and IR enhanced radio-chemo sensitivity by inducing apoptosis (e.g. 42.04% and 32.21% in UM-SCC9) and ROS activity (e.g. 46.3% and 37.4% in UM-SCC9). Conclusions: Our data demonstrate that DSF or DSF/Cu2+ inhibits CSC properties by blocking ALDH enzymatic function. Furthermore, DSF or DSF/Cu2+ in combination with cisplatin and IR enhance cytotoxicity and induce ROS activity. Thus, our findings hold promise for pre- and further clinical evaluation by repurposing DSF as a radio-chemo sensitizer.
Hintergrund: Die ungünstige Prognose des lokal fortgeschrittenen und metastasierten Plattenepithelkarzinoms im Kopf-Halsbereich (HNSCC) ist vor allem auf die Resistenz von Krebsstammzellen (CSCs) gegen die Radiochemotherapie zurückzuführen. ALDH (Aldehyde Dehydrogenase) wurde als Marker verwendet, um CSCs unterschiedlichen Tumoren, einschließlich HNSCC, zu identifizieren. Disulfiram (DSF) ist ein pan-ALDH-Hemmer, der eine bemerkenswerte Aktivität gegen viele Arten von Krebsarten aufweist. Darüber hinaus ist DSF ein starker bivalenter Metallionen-Chelator, der Kupfer (Cu2+) bindet und für eine erhöhte Zytotoxizität verantwortlich ist. Methoden: Die Zellvitalität wurde mit Hilfe von Proliferation - und Apoptose-Assays bewertet. Ein synergistischer Effekt wurde durch die Berechnung des Kombinationsindex (CI) definiert. Die ALDH-Aktivität wurde mittels ALDELUOR-Assay und FACS-Sortierung bestimmt. Stemness-related transcription factors (TFs) wurden mittels qRT-PCR (Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction) nachgewiesen und die zelluläre Selbsterneuerung mittels Spheroid- und Koloniebildungstests gemessen. Die Migrationsfähigkeit wurde durch einen Wundheilungstest bestimmt. Zellzyklus und Aktivität der Reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert. Ergebnisse: Unsere Ergebnisse zeigten eine starke antiproliferative Wirkung von DSF in dosis- und zeitabhängiger Weise. Hunzufügen von Cu2+ führte zu einer drastisch erhöhten Zytotoxizität. DSF oder DSF/Cu2+ reduzierten den Anteil an ALDH-Hoch-CSCs (z.B. von 59,8% auf 33,0% und 30,0% in UM-SCC9) und stemnessbezogenen TFs deutlich. Sie reduzierten auch die Koloniebildung (z.B. von 145 auf 72 und 70 in UM-SCC9), die Sphäroidbildung (z.B. von 39 auf 18 und 20 in UM-SCC9) und die Migrationsfähigkeit (z.B. von 71,85% auf 42,1% und 43,49% in UM-SCC9). DSF oder DSF/Cu2+ induzierten ROS-Bildung und lösten Apoptose aus. DSF oder DSF/Cu2+ haben den Cisplatin-induzierten Zellzyklus G2/M-Phasenstopp (z.B. von 52,9% auf 41,2% und 42,2% bei UM-SCC9) gestoppt, die Resistenz von Cisplatin in ALDH-Hochzellen überwunden und einen synergistischen Effekt in Kombination mit Cisplatin (CI<1) gezeigt. Die Kombination von Strahlung (IR) mit DSF oder DSF/Cu2+ zeigte eine signifikante Wachstumshemmung und reduzierte den Zellzyklus G2/M-Phasenstopp (z.B. von 53,6% auf 40,2% und 41,9% bei UM-SCC9). Darüber hinaus resultierte die Dreifachb ehandlung mit DSF oder DSF/Cu2+, Cisplatin und IR in einer erhöhte Radiochemosensitivität durch Induktion von Apoptose (z.B. 42,04% und 32,21% in UM-SCC9) und ROS-Aktivität (z.B. 46,3% und 37,4% in UM-SCC9). Schlussfolgerung: Unsere Daten zeigen, dass DSF oder DSF/Cu2+ die CSCs-Eigenschaften hemmen, indem sie die enzymatische ALDH-Funktion blockieren. Darüber hinaus erhöhten DSF oder DSF/Cu2+ in Kombination mit Cisplatin und IR die Zytotoxizität und induzierten ROS-Aktivität. Daher ermutigen unsere Ergebnisse DSF als Radio-Chemosensitizer in prä-klinischen und klinischen Studien zu bewerten.
