In the context of drug development for the treatment of complex diseases such as cancer, it might be necessary to interfere with multiple targets. Inspired by the multiple functions of heparan sulfate proteoglycans (HSPGs) several compounds have been developed in the past. Here the fully synthetic dendritic polyglycerol sulfates dPGS and dPGTPS were evaluated with respect to their overall anti-tumorigenic properties. Primarily focused on the sonic hedgehog (Shh) pathway, which is upregulated in several aggressive tumors, it was found that both compounds reduce pathway activation. Shh binding was analyzed via SPR and gave the following KD values: 88.7 nM for dPGS and 37 nM for dPGTPS. The inhibition of the Shh-signaling pathway was further evaluated in two reporter cell-based systems: a luciferase reporter and an alkaline phosphatase (ALP) assay. While dPGTPS showed consistently strong pathway inhibitory activity (IC50 of 72 nM in the ALP and 111 nM in the luciferase assay), dPGS displayed a different behavior (IC50 of 81 nM in ALP and 6.5 µM in luciferase assay), which might be attributed to the different architecture of the polysulfates. Cancer cell line proliferation also mediated by the Shh pathway was further analyzed in 2D cultures and 3D spheroid-based assays. In monolayer 2D studies, dPGS did not show any influence, while dPGTPS at µM concentrations reduced cell proliferation. By contrast, in 3D spheroid-based cultures, both dPGS and dPGTPS, significantly arrested the growth of A549 spheroids, although the latter compound to a lower extent. At the molecular level growth factors mediate cell proliferation. Therefore, binding of FGF1, FGF2, and VEGF165 to the polysulfates was analyzed, again via SPR. All proteins bound tightly to the sulfated compounds (i.e., KD of 25 nM for FGF2-dPGS interaction). Further, the capacity of dPGS to hamper angiogenic processes was confirmed in case of inhibition of HUVECs proliferation. FGF2-induced HUVECs proliferation was reduced upon dPGS treatment (IC50=21 µM) and cell differentiation to initiate three-dimensional capillary-like tube formation dose-dependently blocked. Heparanase is an essential enzyme to initiate remodeling of the extracellular matrix (ECM) during tumorigenesis. The polysulfate dPGS displayed a remarkable affinity to the protein (KD of 3.11 nM) and blocked its enzymatic activity (IC50 = 2 nM). To conclude, these findings emphasize the potential of synthetic polysulfates and should inspire future studies to explore their anti-tumorigenic efficacy.
Für die Entwicklung von Medikamenten die zur Behandlung komplexer Krankheiten eingesetzt werden sollen, kann es hilfreich sein multiple Zielstrukturen zu adressieren. Inspiriert durch die zahlreichen Funktionen der Heparansulfat-Proteoglykane (HSPG) wurden in der Vergangenheit zahlreiche Verbindungen synthetisiert. In dieser Arbeit wurden die vollsynthetisch hergestellten dendritischen Polyglycerinsulfate dPGS und dPGTPS hinsichtlich ihrer antitumorgenen Wirkung untersucht. Zunächst fokussiert auf den Sonic Hedgehog (Shh)-Signalweg, der in vielen agressiven Tumoren reaktiviert wird, konnte gezeigt werden, dass beide Verbindungen die Aktivität vermindern. Bindung des Proteins Shh wurde mittels Oberflächenplasmonresonanz Spektroskopie untersucht und ergab KD Werte von 88,7 nM für dPGS und 37 nM für dPGTPS. Die Inhibition des Shh-Signalweges wurde weiterhin in zwei zellbasierten Systemen evaluiert: einem Luciferase Reportertest und einem Alkalischer Phosphatase (ALP) Reportertest. Während dPGTPS übereinstimmend eine ausgeprägte Hemmung in beiden Reportersystemen zeigte (IC50 von 72 nM im ALP Test und 111 nM im Luciferase-basierten Test), ergab der Einsatz von dPGS ein anderes Bild (IC50 von 81 nM in ALP Test und 6.5 µM in Luciferase-basierten Test), was möglicherweise auf die unterschiedliche Architektur der beiden Polysulfate zurückzuführen ist. Da die Proliferation von Krebszelllinien ebenfalls durch den Shh-Signalweg vermittelt werden kann, wurde dies in 2D-Zellkulturen und im 3D-Spheroid Modell untersucht. In Monolagen wachsender 2D Zellkultur zeigte dPGS keinen Einfluss, während dPGTPS in µM Konzentration eine Reduktion der Zellproliferation ergab. Ein anderes Verhalten ergab sich im 3D-Spheroid Modell. Hier zeigte sich, dass sowohl dPGS als auch dPGTPS signifikant das Wachstum von A549 Spheroiden verzögerte, wobei dPGTPS sich als weniger effektiv erwies. Auf molekularer Ebene vermitteln Wachstumsfaktoren die Zellproliferation. Daher wurde die Bindung von FGF1, FGF2 und VEGF165 an die Polysulfate mittels Oberflächenplasmonresonanz Spektroskopie untersucht. Hierbei zeigten alle Proteine eine hochaffine Bindung an die sulfatierten Verbindungen (z. B. KD von 25 nM für die FGF2-dPGS Bindung). Weiterhin wurde die Fähigkeit von dPGS die Angiogenese zu beeinflussen durch Hemmung der Proliferation am Beispiel von HUVECs bestätigt. FGF2-induzierte Proliferation von HUVECs wurde durch dPGS gehemmt (IC50=21 µM) und Zelldifferenzierung, hin zu einem dreidimensionalem kapillar-ähnlichen Netzwerk, blockiert. Heparanase ist ein essentielles Enzym, das Remodelierungsprozesse der extrazellulären Matrix (ECM) in der Tumorgenese einleitet. Das Polysulfat dPGS zeigte eine bemerkenswerte Bindungsaffinität an das Protein (KD von 3.11 nM) und blockierte dessen enzymatische Aktivität (IC50=2 nM). Zusammenfassend weisen die Befunde auf das hohe Potential der synthetischen Polysulfate hin, die in weitere Studien zur Wirksamkeit ihrer antitumorgenen Eigenschaften untersucht werden sollte.