Muscular dystrophies (MDs) are a heterogeneous group of inherited myogenic disorders characterised by progressive muscle wasting and degeneration. Cell replacement therapies aiming to regenerate and restore the diseased muscles are considered as promising therapeutic strategies for patients affected by MDs. Muscle regeneration relies on satellite cells, the adult stem cells of the skeletal muscle. However, they exist only in low numbers and cannot be extensively cultured and manipulated ex vivo. On the other hand, human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are a keystone to unrestricted numbers of autologous cells, which are necessary for gene correction and repopulation of large muscles in many genetic disorders without evoking an immune response. hiPSCs have been generated from many different cell types and several protocols have been established to differentiate them into muscle cells or dedicated muscle stem cells. However, the biotechnological and therapeutic capabilities of these induced myogenic cells remain unclear. In addition, whether the epigenetic memory passed on to the hiPSCs from the somatic cell type they originated from has an influence on their myogenic differentiation capacity has not yet been examined.
Myoblasts and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) represent the most relevant cell types for the generation of autologous hiPSCs for the treatment of muscular disorders, as blood samples are easy to retrieve from donors and myoblasts can easily be extracted from muscle biopsy specimens that are regularly taken for diagnostic purposes from patients with suspected muscular dystrophies. Thus, we compared primary human myoblasts and human PBMCs, derived from the same donor (n=4), with regard to their ability to reprogramme into hiPSCs, their transcriptomic characteristics and their ability to differentiate into the myogenic lineage using a directed transgenefree differentiation protocol. In addition, we investigated the potential of the hiPSC-derived induced myogenic cells to contribute to myofibre regeneration in an immunocompromised mouse model.
We found considerable differences in the ability of primary myoblasts and PBMCs to reprogramme into hiPSCs with a higher efficiency for myogenic cells. RNA-Sequencing of myoblastand PBMC-derived hiPSCs revealed 122 significantly differentially expressed transcripts that are involved in signalling pathways potentially influencing the differentiation capacities of pluripotent stem cells.
However, the in vitro differentiation experiments revealed no significant differences in the number of myogenic cells obtained after differentiation of myoblast- and PBMC-derived hiPSCs from the same donor. On the other hand, we found distinct differences between the donors, clearly showing an influence of the donor’s genetic background on the ability of hiPSCs to differentiate into the myogenic lineage in vitro.
Finally, intramuscular transplantation of induced myogenic progenitor cells into immunocompromised mice resulted in human myofibre formation for both, myoblast- and PBMCderived myogenic cells. However, the human muscle fibres remained small in diameter and the overall number of human myofibres remained low, which hampered a reliable quantitative comparison between the two cell types.
The results obtained in this study show no difference in the vitro myogenic differentiation efficiency of myoblast- and PBMC-derived hiPSCs. However, we show that, when readily available, myoblasts are a better cell source to generate autologous hiPSCs for patients with muscular dystrophies due to their significant higher reprogramming efficiency as compared to PBMCs.
This work highlights the existence of intrinsic differences between hiPSC lines and their impact on the differentiation capacity, some of which being related to the genetic background of the donor. A thorough understanding of the factors responsible for these differences will be of great value to improve the differentiation protocols for the myogenic lineage and to help select hiPSCs with the highest prospects of success for obtaining large numbers of myogenic cells with the potential for robust myofibre regeneration in vivo.
Muskeldystrophien sind eine heterogene Gruppe von erblichen Muskelerkrankungen, die durch progressive Muskeldegeneration charakterisiert sind. Zellersatztherapien zielen darauf ab die geschädigten Muskelzellen zu ersetzten und den degenerierten Muskel zu regenerieren und gelten als vielversprechende therapeutische Strategie zur Behandlung von Patienten mit Muskeldystrophien. Die Regeneration von Muskelgewebe hängt von muskelspezifischen Stammzellen ab, den sogenannten Satellitenzellen. Satellitenzellen kommen jedoch nur in sehr geringer Anzahl vor und sind daher nicht in ausreichendem Maße für eine ex vivo Kultivierung und genetische Korrektur vorhanden. Humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) hingegen, stellen den Schlüssel zu einer uneingeschränkten Anzahl autologer Zellen dar, die zur genetischen Korrektur und zur Regeneration von großen Muskeln benötigt werden, ohne dass es dabei zu Immunabstoßungsreaktionen kommt. hiPSCs wurden bereits aus diversen Zelltypen generiert. Zudem wurden bereits diverse Protokolle zur Generierung von Muskelzellen oder auch Muskelstammzellen aus hiPSCs etabliert. Dennoch ist das biotechnologische und therapeutische Potential dieser aus hiPSCs induzierten Muskelzellen bisher unklar. Auch der Einfluss des somatischen Ursprungszelltyps der hiPSCs auf ihre Kapazität in Muskelzellen zu differenzieren ist nicht abschließend geklärt.
Myoblasten und periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) stellen die beiden Zelltypen mit der größten Relevanz für die Generierung von autologen hiPSCs zur Behandlung von Muskeldystrophien dar. Blutproben sind leicht zu entnehmen und Myoblasten können aus Muskelbiopsie-Proben isolierten werden, die zu diagnostischen Zwecken von Patienten mit Verdacht auf Muskelerkrankungen entnommen werden. Daher wurden in dieser Arbeit humane Myoblasten und PBMCs vom selben Donor isoliert (n=4) und deren Kapazität zur Reprogrammierung in hiPSCs untersucht. Zudem wurden die generierten hiPSCs auf transkriptioneller Ebene verglichen und, unter Verwendung eines nicht-integrativen myogenen Differenzierungsprotokolls, ihre Kapazität zur in vitro Differenzierung in die myogene Linie bestimmt. Im Anschluss wurde das Potential dieser aus hiPSCs induzierten Muskelzellen zur Bildung von humanen Muskelfasern in einem immunsupprimierten Mausmodell analysiert.
Die Reprogrammierung in hiPSCs war mit Myoblasten deutlich effizienter als mit PBMCs. Der Vergleich der generierten hiPSCs auf transkriptioneller Ebene ergab 122 signifikant unterschiedlich exprimierte Transkripte zwischen den beiden Zelltypen. Diese Transkripte sind in Signalwege mit potentiellem Einfluss auf die Differenzierungskapazitäten dieser pluripotenten Stammzellen involviert.
Dennoch zeigten die in vitro Differenzierungsexperimente keine signifikanten Unterschiede in der Anzahl an generierten Muskelzellen zwischen den aus Myoblasten und PBMCs generiertenhiPSCs vom selben Donor. Die Differenzierungskapazität der hiPSCs aus verschiedenen Donoren unterschied sich allerdings stark voneinander, was den Einfluss des genetischen Hintergrunds auf die Differenzierungskapazität zeigt.
Die Transplantation von aus hiPSCs generierten induzierten Muskelvorläuferzellen zeigte in beiden Zelltypen das Potential zur Muskelfaserregeneration. Die regenerierten Muskelfasern waren jedoch klein und ihre Anzahl war gering. Daher war eine Quantifizierung der Unterschiede nach Transplantation zwischen den aus Myoblasten und den aus PBMCs generierten Muskelzellen nicht sicher möglich.
Die Versuche in dieser Studie zeigen keine Unterschiede in der Effizienz zur Muskeldifferenzierung zwischen den aus Myoblasten und den aus PBMCs generierten hiPSCs. Dennoch kommen wir zu dem Schluss, dass zur Generierung von hiPSCs, falls vorhanden, Myoblasten verwendet werden sollten, da mit diesen eine signifikant höhere Reprogrammierungseffizienz erreicht wurde.
Diese Arbeit stellt den Einfluss von Faktoren heraus, die für intrinsischen Unterschiede zwischen hiPSC Linien verantwortlich sind und deren Differenzierungspotential beeinflussen. Diese Unterschiede sind unter anderem auf den genetischen Hintergrund der Spender zurückzuführen. Ein besseres Verständnis dieser Faktoren könnte eine Optimierung der Muskeldifferenzierungsprotokolle und eine Selektion der hiPSCs ermöglichen, um eine ausreichende Menge an potenten induzierten Muskelzellen zu generieren.
