Multiple Sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disorder of the central nervous system (CNS), characterized by lymphocyte infiltration and inflammation of the CNS leading to dymelination and axonal/neuronal damage. Despite the development of promising treatment strategies in the murine model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), the detailed therapeutic target mechanisms and the disease underlying cellular and molecular pathways directly in the CNS still remain uncertain, since specific issues regarding immune cell dynamics and the complex neuro-immune crosstalk can not be addressed by conventional experimental approaches. To overcome these limitations I applied time lapse two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) to investigate the cellular migration of various T cell subsets in living brain tissue. First, T cells, isolated from atorvastatin treated mice or after pharmacological activation of the bradykinin receptor B1 revealed a reduced migratory capacity as compared to vehicle treatment. Secondly, cellular dynamics of differentiated effector CD4 T cells are characterized by a predominant vessel alignment in contrast to CD8 T cells, which randomly infiltrate the whole CNS parenchyma. This CD4 T cell compartmentalization was mediated by CXCR4 functioning, whereas the adhesion molecules LFA-1 and the chemokine receptor CCR7 are not involved in this homing process. Obviously, TPLSM allows to visualize cellular dynamics deep in intact tissues and thereby contributes to the clarification of therapeutic but also general pathologic target pathways. However some pitfalls still remain due to limited excitation wavelengths between 780-1050 nm. The evaluation of long wavelength infrared (IR) excitation by an optical parametric oscillator (OPO) versus near infrared (NIR) excitation by a Titanium:Sapphire (Ti:Sa) laser revealed enhanced penetration depths, an increased depth-dependent spatial resolution and a reduced photobleaching for OPO-excited tdRFP (tddimer2(12) red fluorescent protein) as compared to Ti:Sa-excited EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) in brain slices, explanted lymph nodes and in the brain of living anesthetized mice. As far as the development of new experimental approaches is concerned, it is further demonstrated that two red fluorescent proteins, i.e. tdRFP and mCherry, can be simultaneously excited and spectrally separated by the OPO-based TPLSM setup. Moreover, using dual Ti:Sa- and OPO-based TPLSM both, cellular dynamics and functional responses, can be visualized during CNS-inflammation. In summary, additionally to the demonstrated advantages regarding image quality new possibilities emerge to elucidate detailed pathomechanisms in the target organ of neuroinflammation by the use of extended excitation wavelengths for TPLSM.
Multiple Sklerose (MS) ist eine chronisch entzündliche Erkrankung des Zentralen Nervensystems (ZNS), deren charakteristische Merkmale Demyelinierung und axonaler/neuronaler Schaden durch Lymphozyteninfiltration und Entzündung des ZNS initiiert werden. Trotz der Entwicklung vielversprechender Therapieoptionen im murinen Tiermodell der MS, so sind die detaillierten Zielmechanismen sowie die zugrunde liegenden zellulären und molekularen Mechanismen direkt im ZNS nur unzureichend erklärt. Dies begründet sich unter anderem darin, dass spezifische Aspekte wie zum Beispiel die Dynamik und komplexe Kommunikationsvorgänge der Immun- und ZNS-Zellen mit konventionellen experimentellen Ansätzen nicht vollständig untersucht werden können. Ziel der Arbeit war es daher, das Migrationsverhalten verschiedener Immunzellsubtypen im Gehirn mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie zu untersuchen. Diese Untersuchungen ergaben, dass eine pharmakologische Modulation von T-Zellen mittels Atrovastatin sowie durch die Aktivierung des Bradykinin-Rezeptors B1 zu einer verringerten Migrationsfähigkeit und Infiltration von lebendem Hirngewebe führte. Weitere Untersuchungen zeigten zudem, dass sich aktivierte CD4-positive T-Zellen entlang der Gefäßstruktur im Hirngewebe bewegen, während CD8-positive Zellen das gesamte ZNS-Parenchym infiltrieren und eine primäre Gefäßassoziation nicht zu beobachten war. Diese Gefäßassoziation wird über CXCR4, aber nicht über CCR7 und LFA-1 vermittelt. Obwohl diese Untersuchungen sehr deutlich zeigen, dass die Zwei-Photonen-Mikroskopie eine wichtige Methode zur Untersuchung des Immunzellverhaltens im ZNS ist und maßgeblich zur Aufklärung der Pathogenese beiträgt, so weisen konventionelle Zwei-Photonen- Laser aufgrund ihres begrenzten Wellenlängenspektrums zwischen 700-1080 nm Einschränkungen hinsichtlich ihrer Anwendung für die intravitale Zwei- Photonen-Mikroskopie auf. Deshalb wurde im zweiten Teil der Arbeit der Einfluss höherer Anregungswellenlängen auf die Bildqualität und auf die Entwicklung neuer experimenteller Ansätze untersucht. Systematische Vergleichstudien zeigten, dass eine längerwellige Anregung über 1080 nm mittels eines optischen parametrischen Oszillators (OPO) zu erhöhten Eindringtiefen, einer besseren Auflösung in tiefen Gewebsschichten und einer geringeren Photobleichung führt. Der Schwerpunkt der Untersuchungen lag hier auf der intravitalen Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Untersuchung der Pathomechanismen im lebenden Organismus. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass eine simultane Anregung durch einen konventionellen Zwei- Photonen-Laser zusammen mit einem OPO, nicht nur die Visualisierung der Immunzellmigration sondern auch die Visualisierung der Kommunikation der Immunzellen mit Zellen des ZNS und deren funktionelle Konsequenz in vivo ermöglicht.
