Die adoptive T-Zell-Therapie hat zum Ziel, T-Zellen mit einem Tumorantigen-spezifischen TCR (T-Zell-Rezeptor) auszustatten, sie in vitro zu vermehren, einem Tumorpatienten zu injizieren und so eine gegen den Tumor gerichtete Immunantwort zu induzieren. Für die Verwendung dieses TCR in anderen Tumorpatienten muss bekannt sein, auf welches MHC (major histocompatibility complex)-Molekül er restringiert ist. Dafür können mit diesem TCR transduzierte PBL (Lymphozyten des peripheren Blutes) mit MHC-Tetrameren angefärbt oder mit LCL (B-Lymphoblasten-Zelllinien) ko-kultiviert werden. Die Tetramer-Färbung ist für CD8 (cluster of differentation)-TCR eine etablierte Methode. Für die Restriktionsanalyse an CD4-TCR hat sie sich als ungeeignet erwiesen.
In dieser Arbeit wurde eine MHC II-Zellbibliothek etabliert, indem HLA (humanes Leukozytenantigen, humanes MHC)-DRA, 13 verschiedene HLA-DRB-Allele und die für die Antigenprozessierung bedeutsamen Moleküle HLA-DM und Ii (Invariant Chain) mittels PCR mit spezifischen Primern aus LCL isoliert und in MP71 Retrovirusvektoren kloniert wurden. Eine Verpackungszelllinie wurde mit den einzelnen Plasmiden transfiziert und es wurden retrovirale Zellkulturüberstände gewonnen. Die HLA-negative humane K562 Zelllinie wurde mit den retroviralen Überständen aus HLA-DRA und einzelnen HLA-DRB transduziert und die Expression der Transgene durchflusszytometrisch bestimmt.
Die Zellen der auf diese Weise entstandenen MHC II-Zellbibliothek wurden nach Beladung mit Peptid 16.01 des L1 Kapsidproteins des HPV 16 (Humanen Papillomvirus 16) oder nach Elektroporation mit ivtRNA (in vitro transkribierter RNA) des vollständigen L1 Antigens mit PBL ko-kultiviert, die zuvor mit einem Peptid 16.01 spezifischen CD4-TCR transduziert wurden. In den Ko-Kultur-Überständen wurde die Interferon-γ-Konzentration mittels ELISA bestimmt. Die gleichen Versuche wurden nach Transduktion von K562 Zellen der MHC II-Bibliothek mit Ii, HLA-DM und beiden Transgenen durchgeführt sowie mit monoklonal HLA-DRA exprimierenden K562 Zellen.
Es wurde gezeigt, dass K562 Zellen alle einzeln transduzierten HLA-DRB-Allele im Komplex mit HLA-DRA auf der Zelloberfläche exprimieren. Die Ko-Kultur mit den PBL zeigte, dass der TCR auf HLA-DRA/HLA-DRB1*07:01 restringiert ist.
Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass K562 Zellen L1 effektiv prozessieren und präsentieren können. Monoklonale K562 HLA-DRA/HLA-DRB1*07:01 Zellen und K562 HLA-DRA/HLA-DRB1*07:01 Zellen, transduziert mit Ii und/oder HLA-DM, zeigten keine bessere Antigenpräsentationsfähigkeit.
Damit konnte bestätigt werden, dass mithilfe der hier vorgestellten MHC II-Bibliothek die Restriktion eines CD4-TCR analysiert werden kann. Dafür muss weder eine spezifische Epitopsequenz bekannt sein, noch braucht es Ii oder HLA-DM.
Adoptive T-cell therapy aims at genetically engineering T cells to express a tumor-antigen specific TCR (T-cell receptor), cultivating those cells in vitro and injecting them into a tumor patient, where they are supposed to induce an immune reaction against the tumor. For therapeutic use in other patients, the MHC (major histocompatibility complex) restriction of this TCR needs to be identified. Therefore, TCR-transduced PBLs (peripheral blood lymphocytes) can be stained with MHC tetramers or co-cultured with LCLs (B-lymphoblastoid cell lines). Tetramer staining is a well-established method for restriction analysis of CD8 (cluster of differentation) TCRs but proved unsuitable regarding CD4 TCRs. In this thesis, an MHC II cell library was established by isolating HLA (human leukocyte antigen; human MHC)-DRA, 13 different HLA-DRB alleles, HLA-DM and Ii (invariant chain) from LCLs via PCR with specific primers and cloned into MP71 retroviral vectors. A packaging cell line was transfected with the plasmids and retroviral supernatants were harvested. The HLA negative, human K562 cell line was transduced with retroviral supernatants derived from HLA DRA and individual HLA-DRB alleles. Expression of the transgenes was analyzed with flow cytometry. Cells from this MHC II cell library were exogenously loaded with peptide 16.01 from the L1 capsid protein of the human papilloma virus 16 or electroporated with ivtRNA (in vitro-transcribed RNA) from the whole L1 antigen and co-cultured with PBLs previously transduced with a peptide 16.01 specific CD4 TCR. Interferon-γ concentration in the co-culture supernatant was measured with ELISA. The same experiments were conducted with the MHC II cell library after transduction with HLA-DM and/or Ii and with monoclonally HLA-DRA expressing K562 cells. It could be shown that K562 cells express all individually transduced HLA-DRB alleles with HLA-DRA on their cell surfaces. Co-culture with the TCR-transduced PBLs revealed the TCR to be restricted to HLA-DRA/HLA-DRB1*07:01. Furthermore, the experiments disclosed for K562 cells to be able to efficiently process and present L1. Besides, monoclonal K562 HLA-DRA/HLA-DRB1*07:01 cells and those which were transduced with Ii and/or HLA-DM did not exhibit a better antigen presentation ability. Thereby, the MHC II cell library is an appropriate tool for restriction analysis in CD4 TCRs for which the experimenter neither needs HLA-DM, Ii nor the exact epitope sequence.
