Proteine mit spezifischen Bindungseigenschaften, enzymatischen Aktivitäten und physiko-chemischen Charakteristika sind leistungsfähige Werkzeuge für die Forschung sowie für biotechnologische und diagnostische Anwendungen. Darüber hinaus spielen bestimmte Proteine, die Antikörper, ein zentrale Rolle bei der Entwicklung von Biopharmaka. Dabei sind in vitro-Selektionsmethoden wie das Phagen-Display die Mittel der Wahl, um gegen nahezu alle beliebigen Antigene Antikörper zu selektieren und zu optimieren. Das Arbeiten mit filamentösen Phagen ist jedoch an das E. coli Expressionssystem gebunden und es können daher nur in E. coli exprimierbare Proteine selektiert und optimiert werden. In Bezug auf Antikörper stehen somit nur Antikörperfragmente, in erster Linie das scFv-Fragment und das Fab-Format, zur Verfügung. Im Gegensatz zum scFv garantiert das Fab-Fragment eine hohe Stabilität sowie monomeres Auftreten und lässt sich leicht und ohne Funktionsverlust in ein vollständiges Immunglobulin umwandeln. Die (periplasmatische) Expression von Fab-Fragmenten in E. coli stellt jedoch ein multifaktorielles Problem dar und ist häufig mit der Bildung von Aggregaten, sogenannten Einschlusskörpern, verbunden. Die Ausbeute an löslichem Protein ist nicht zuletzt dadurch gering. Diese Arbeit hat zum Ziel, die Ausbeute an funktionellem Fab mittels Zufallsmutagenese innerhalb der konstanten Domänen der leichten und schweren Kette des Modellantikörpers CB4 -1 zu erhöhen. Generierte Antikörpergenbibliotheken wurden unter optimierten Selektionsbedingungen gescreent und Selektionsmutanten durch DNA-Shuffling weiter optimiert. Drei verbesserte Varianten wurden anschließend hinsichtlich ihrer Affinität und Stabilität in Bezug zum Ausgangskonstrukt Fab4myc charakterisiert. Dabei konnte eine um einen Faktor von bis zu 28 verbesserte Fab-Expression ermittelt werden. Des Weiteren wurden für alle drei Varianten Bindungseigenschaften ermittelt, die mit denen des Fab4myc übereinstimmten. Stabilitätsuntersuchungen mit Hilfe von Guanidinhydrochloridtitration und Dynamischer Differenzkalorimetrie (DSC) zeigten nur für zwei Konstrukte eine leicht verringerte Stabilität. Es konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass das Phagen-Display-System neben dem Screenen auf Affinität auch ein brauchbares Werkzeug für die Expressionsoptimierung von Proteinen darstellt. In Bezug auf Phagen-Display-Systeme, die auf dem Fab-Format basieren, ist zu erwarten, dass der Einsatz modifizierter konstanter Domänen zur Verminderung des in vivo-Selektionsdrucks beiträgt und dadurch die Komplexität der Bibliothek erhöht. Die zusätzliche Überprüfung einer allgemeinen Übertragbarkeit der verbesserten Fab-Expression durch optimierte konstante Domänen führte in zwei von drei Fällen zu einem positiven Ergebnis. Hierbei wurde deutlich, dass neben den konstanten Domänen auch VH einen Einfluss auf die funktionelle Fab-Expression hat.
Proteins with specific binding properties, enzymatic activities and physicochemical characteristics are effective tools for research as well as biotechnical and diagnostic applications. Moreover, certain proteins - antibodies - play key roles in the development of biotherapeuticals. Phage display is currently one of the most frequently used in vitro methods for the selection and optimisation of antibodies against the vast majority of arbitrary antigens. Work with filamentous phages is tied to the E. coli expression system and thus only proteins expressible in E. coli can be selected and optimised. In terms of antibodies, only antibody fragments such as scFv- and Fab-Fragment are available. In contrast to the scFv-Fragment, the Fab-Fragment ensures high stability, as well as monomeric formation and is easy to convert into whole human immunoglobulins without loss of functionality. The periplasmic expression of Fab-Fragments in E.coli presents a multifactorial problem which is often related to the formation of insoluble aggregates, also known as inclusion bodies. The expression yield of soluble protein is however, relatively low. The aim of this task was to increase the expression yield of functional proteins in the model antibody CB4-1 by mutagenesis within the constant domains of the heavy and light chain. Generated antibody libraries were screened and selected under optimised conditions and the selected mutants further optimised by DNA-shuffling. Three improved expression variants were then characterised according to affinity and stability concerning the wildtyp Fab-fragment Fab4myc, whereby an increased Fab-expression yield of factor 28 could be determined. In addition, similar binding properties for all four constructs were able to be determined. Analysis of stability with the support of guanidium hydrochloride titration and differential scanning calorimetry (DSC) revealed a slight decrease in stability for two constructs. The results of the task demonstrated, that besides in screening for affinity, the phage display system proved to be a viable tool for the optimised expression of proteins. With regards to Fab- format based phage display systems, it is expected that the insertion of modified constant domains contribute to the decrease of the in vivo selective pressure and as a result increase the library complexity. A further examination of the general communicability of improved Fab-expression by optimised constant domains yielded a positive result in two out of three cases. It is therefore concluded, that alongside constant domains, VH must also have an influence on functional Fab expression.
