Molecular Requirements for RIF1 Role in DNA Double-Strand Break End Protection

Abstract

Mammalian Rap1-interacting factor 1 (RIF1) is a multifunctional protein required for DNA replication timing, restart of stalled replication forks, resolution of anaphase bridges and non-homologous end joining (NHEJ) repair of DNA double-strand breaks (DSBs). NHEJ repair is essential in certain contexts but can be detrimental in others. On one hand, defective NHEJ hampers the ability of B lymphocytes to undergo antibody class switch recombination (CSR) and leads to life-threatening immunodeficiencies. On the other hand, the predominance of NHEJ over homologous recombination (HR) in HR-deficient cells can cause the accumulation of mutations, genomic aberrations, and tumorigenesis. DSB end resection is an important step in the DSB repair pathway choice and RIF1 promotes NHEJ repair partly by protecting DSB ends from extensive resection. How the process of DSB end protection is regulated, especially in the context of CSR, remains unclear. Specifically, the full picture of interactor proteins, as well as the post-translational modifications (PTMs) that may regulate RIF1 function in DSB repair, have not been defined yet. Therefore, the characterization of RIF1 interacting partners and PTMs will be instrumental for our understanding of the mechanisms underlying DSB end protection during CSR in B cells and genomic instability in HR-deficient cells. To this aim, first I conducted a loss-of-function screen to test the involvement of potential RIF1 interactors in isotype switching. I identified ARPC1A, a protein involved in actin polymerization, as a factor affecting CSR upon bulk somatic targeting. ARPC1A, whose function in CSR has not been reported yet, may represent a link between these two processes that so far were considered unrelated. Second, I assessed the requirement for DSB end protection of three RIF1 conserved, clustered SQ motifs that we found to be phosphorylated in primary B lymphocytes undergoing CSR. To investigate if the phosphorylation status of these sites contributed to modulate RIF1 function during DSB end protection, I generated and tested the ability of RIF1 phosphomutant cell lines to undergo CSR. I proved that the phosphorylation status of the conserved SQ cluster does not affect RIF1 ability to support CSR. Furthermore, RIF1 phosphomutants failed to rescue genomic instability in a BRCA1-deficient background. These findings indicate that the phosphorylation of the conserved SQ sites is dispensable for RIF1 role in DSB end protection.

Das Rap1-interacting factor 1 (RIF1) ist ein multifunktionales Protein, welches unter anderem den Prozess der DNA-Replikation zeitlich koordiniert sowie am Neustart blockierter Replikationsgabeln, der Auflösung von Anaphase-Brücken und der Nicht-homologen Endverknüpfung (non-homologous end joining, NHEJ) von DNA-Doppelstrangbrüchen (DNA double-strand breaks, DSBs) beteiligt ist. Die NHEJ Reparatur ist in bestimmten Zusammenhängen unerlässlich, kann jedoch in anderen nachteilig sein. Einerseits beeinträchtigen Defekte in der NHEJ die Fähigkeit von B Lymphozyten, einen Antikörper-Isotypen-Wechsel (class switch recombination, CSR) durchzuführen, was zu lebensbedrohlicher Immundefizienz führen kann. Andererseits kann eine Prädominanz des NHEJ im Vergleich zur homologen Rekombination (homologous recombination, HR) in HR-defizienten Zellen zur Akkumulation von Mutationen, genomischen Aberrationen und zur Tumorigenese führen. DSB-Endresektion ist ein wichtiger Schritt im Signalweg der DSB-Reparatur und das RIF1 Protein fördert die NHEJ teils durch den Schutz der DSB-Enden vor extensiver Resektion. Wie der Schutz der DSB-Enden genau reguliert ist, vor allem im Kontext des CSR ist bisher nicht untersucht. Insbesondere ist bisher nichts über die Gesamtheit aller Interaktionspartner sowie die post-translationalen Modifikationen bekannt, welche die Funktion von RIF1 im Prozess der DSB-Reparatur regulieren könnten. Die Charakterisierung der Interaktionspartner von RIF1 sowie die Untersuchung seiner post-translationalen Modifikationen wird daher entscheidend zum Verständnis der Mechanismen, die der DSB-Endprotektion während des CSR in B Zellen sowie der genomischen Instabilität in HR-defizienten Zellen unterliegen, beitragen. Folglich habe ich in dieser Studie zunächst ein Loss-of-Function Screen zur Untersuchung potentieller RIF1-Interaktionspartner im Prozess des CSR durchgeführt. Hierbei habe ich ARPC1A als ein Faktor identifiziert, welcher den CSR beeinflusst. ARPC1A ist ein Protein, welches in die Polymerisation von Aktin involviert ist und für welches bisher keine Funktion im Prozess des CSR beschrieben wurde; als solches könnte ARPC1A jedoch einen ersten Link zwischen diesen beiden Prozessen, die bisher als unzusammenhängend angesehen wurden, darstellen. Zudem habe ich den Einfluss dreier konservierter, geclusterter SQ Motive von RIF1 im Prozess der DSB-Endprotektion untersucht, bei welchen zuvor eine spezifische Phosphorylierung während des CSR in primären B Zellen festgestellt wurde. Um zu untersuchen, ob der Phosphorylierungs-Status dieser Abschnitte die Funktion von RIF1 im Prozess der DSB-Endprotektion beeinflusst, habe ich RIF1-phosphomutante Zelllinien generiert und deren Fähigkeit des CSR durchzuführen, untersucht. Hierbei konnte ich zeigen, dass der Phosphorylierungs-Status der konservierten SQ Cluster die Funktion von RIF1 im CSR nicht beeinflusst. Des Weiteren konnten die generierten RIF1-Phosphomutanten die genomische Instabilität in einem HR-defizienten Hintergrund nicht verhindern. Aus diesen Ergebnissen ist zu schließen, dass die Phosphorylierung der konservierten SQ Abschnitte keinen entscheidenden Einfluss auf die Rolle des RIF1 Proteins in der DSB-Endprotektion hat.