Die Primäre Mikrozephalie, das Seckel-Syndrom und der Mikrozephale Osteodysplastische Primordiale Zwergwuchs Typ Majewski II (MOPD II) sind autosomal-rezessive Erkrankungen, die unter anderem durch eine ausgeprägte Reduktion der Gehirngröße als Folge einer verminderten Produktion von Neuronen während der Embryogenese charakterisiert sind. Trotz ähnlichem klinischem Phänotyp sind die genetischen Ursachen genannter Erkrankungen heterogen: So ist bekannt, dass Mutationen von ATR (Ataxia telangiectasia and Rad3 related), einer für die Antwort auf DNA-Schädigung wichtigen Proteinkinase, zum Phänotyp des Seckel-Syndroms führen. Bei Patienten mit Seckel-Syndrom ohne ATR- Mutation, wie auch bei Patienten mit MOPD II konnten kürzlich Mutationen von PCNT nachgewiesen werden. Weiterhin führen Mutationen im MCPH1-Gen zum Phänotyp der Primären Mikrozephalie. Wie auch ATR, spielen die entsprechenden Genprodukte, Microcephalin (MCPH1) und Pericentrin (PCNT), eine wichtige Rolle für die Initiierung und Progression der Mitose, sowie in der zellulären Antwort auf eine DNA-Schädigung. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Funktionen von PCNT und MCPH1 im Hinblick auf zentrosomale Mechanismen der Mitoseregulation untersucht, insbesondere auf die räumliche und zeitliche Regulation der Checkpoint Kinase 1 (Chk1). Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl ein mutationsbedingter als auch RNAi-vermittelter Verlust von MCPH1 oder PCNT zu einer zentrosomalen Delokalisation von Chk1 führt und somit beide Proteine für die zentrosomale Lokalisation von Chk1 während der Interphase notwendig sind. Darüber hinaus konnten Interaktionen zwischen MCPH1, PCNT und Chk1 in vivo nachgewiesen und alle drei Proteine in einem Komplex isoliert werden. Mit Hilfe eines im Rahmen dieser Arbeit hergestellten monoklonalen Antikörpers gegen humanes MCPH1 wurde weiterhin die subzelluläre Distribution dieses Proteins genauer analysiert. Die Untersuchungen zeigen eine zentrosomale Lokalisation von MCPH1 während der Interphase, analog der Lokalisationen von PCNT und Chk1; MCPH1 und Chk1 lassen sich darüber hinaus auch im Zellkern detektieren. Die Ergebnisse zeigen ebenfalls, dass die Defizienz von MCPH1 zu einer Reduktion von zentrosomalem PCNT führt, was auf eine Beteiligung von MCPH1 auch an der zentrosomalen Rekrutierung von PCNT hinweist. Neben diesen strukturellen Zusammenhängen wurde auch der funktionelle Aspekt der beobachteten Interaktionen im Hinblick auf die Regulation des Zellzyklus untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass die durch den Verlust von PCNT bzw. MCPH1 bedingte Delokalisation von Chk1 zu einer vorzeitigen Aktivierung des Cyclin B/Cdk1-Komplexes und somit einem verfrühten Eintritt in die Mitose führt. Die mittels mikroskopischer Zeitrafferaufnahmen dokumentierten Effekte dieser Zellzyklusderegulation im Sinne einer verlängerten Mitosedauer, wie auch einer erhöhten Zelltod-Rate während der Mitose, implizieren eben diese Störung des Zellzyklus als gemeinsame molekulare Endstrecke in der Pathogenese von Primärer Mikrozephalie und MOPD II, und erklären somit den ähnlichen klinischen Phänotyp dieser genetisch unterschiedlichen Entitäten.
Primary microcephaly, Seckel syndrome, and microcephalic osteodysplastic primordial dwarfism type II (MOPD II) are autosomal recessive disorders exhibiting marked microcephaly with reduced brain size reflecting decreased neuron production during fetal life. Despite showing similar clinical phenotypes, the genetic cause of these disorders is heterogeneous: Some individuals with Seckel syndrome harbour a mutation in the ataxia- telangiectasia and Rad3-related (ATR) gene, which encodes a kinase that has an essential function in coordinating the response to DNA damage. Recently, it has been reported that mutations in pericentrin (PCNT) also cause Seckel syndrome and MOPD II. Microcephalin (MCPH1) was the first causative gene being identified in patients with primary microcephaly. The corresponding gene products, ATR, PCNT, and MCPH1 play a crucial role in DNA damage response signalling as well as in the regulation of mitotic initiation and progression in unperturbed cells. The aim of the presented dissertation was to examine the function of PCNT and MCPH1 in centrosome-mediated regulation of mitosis, in particular their role in spatiotemporal regulation of checkpoint kinase 1 (Chk1). The results showed that Chk1 is lost from centrosomes in MCPH1- and PCNT-deficient cells derived from individuals with primary microcephaly and MOPD II, as well as in cells treated with MCPH1- and PCNT-specific siRNAs. These data indicate that MCPH1 and PCNT are required to recruit Chk1 to the centrosome during the interphase of the cell cycle. Further results showed that Chk1, MCPH1 and PCNT not only interact with each other in vivo, but also are detectable in the same protein-complex. The creation of a monoclonal antibody, raised against the N-terminal fragment of human MCPH1 enabled us to analyze the subcellular distribution of this protein. The data show that MCPH1 localizes to interphase centrosomes, similar to the localizations of PCNT and Chk1; both MCPH1 and Chk1 could also be detected in the nucleus. Furthermore, the observation of significantly reduced levels of centrosomal PCNT indicates that MCPH1 contributes to the centrosomal recruitment of PCNT. In addition to the structural context we also examined the functional aspects of the observed interactions, in particular regarding their effects on cell cycle regulation. The results demonstrate that depletion of MCPH1 or PCNT and the ensuing loss of Chk1 from the centrosome lead to premature activation of cyclin B/Cdk1, thus resulting in a premature entry into mitosis. Time-lapse video microscopy of MCPH1- and PCNT-depleted cells showed this deregulation of cell cycle control to cause a significant delay in mitosis, as well increased rates of cell death in the affected cells. Consequently, loss of regulatory restraints on the initial activation of cyclin B–Cdk1 at the centrosome might be a common final path in microcephalic disorders with reduced body size, thereby explaining for the first time why seemingly unrelated genetic defects result in a common human disease phenotype.
