Severe malaria is a life threatening disease caused by Plasmodium falciparum. Glycosylphosphatidylinositol (GPI) glycolipids specific to P. falciparum are abundant on the parasite surface and are implicated as a toxin in severe malaria. Glycoconjugate vaccines that induce GPI specific antibodies are predicted to ameliorate the hyper-inflammatory response against the native GPI toxin and protect against severe malaria. Here, I disclose the immunogenic properties of designed synthetic GPI glycoconjugates. Binding specificities of polyclonal and monoclonal antibodies induced by various synthetic GPI glycoconjugates were profiled using microarrays displaying synthetic GPI epitopes. This profiling gave detailed insight about how residues of the GPI core backbone affect the specificity of the induced antibodies. Based on the derived antibody specificity profile, synthetic GPI antigens PEtN Man3 and PEtN Man4 were designed to induce antibodies recognizing the non reducing terminus of the core GPI backbone. I reasoned that antibodies against this terminal epitope, specific to P. falciparum GPI, may protect against the toxic hyper inflammatory response implicated in severe malaria. Since GPIs are inflammatory only in the context of the full glycolipid, with the reducing end masked by the lipid tail, binding to the terminal non-reducing epitope may be enough to stop inflammation. Also, these antibodies would share epitope specificities with naturally occurring GPI specific antibodies. As predicted, immunisation with both glycoconjugates reproducibly induced high antibody titres recognising the targeted terminal epitope. Monoclonal antibodies against the target epitope were also generated after immunisation. Though the current glycoconjugate formulation did not protect against neurological symptoms in the mouse model of experimental cerebral malaria, it may be protective in other malaria models if a Th2 bias is needed. Furthermore, different glycoconjugate formulations can also be investigated to balance Th1/Th2 responses. Serendipitously, I discovered that the antibodies were cross reactive with L. mexicana, so possible protective effects of immunisation against other protozoan diseases may be explored. This thesis demonstrates that reliable and effective strategies for glycoconjugate vaccine design are strengthened by glycan microarray profiling. Designed antigens can be further formulated into glycoconjugates to produce poly- and monoclonal antibodies specific to targeted epitopes.
Schwere Malaria ist eine durch den Parasiten P. falciparum ausgelöste lebensbedrohliche Krankheit. Die Parasiten tragen an der Oberfläche ein Kohlenhydratlipid, das Glycophosphatidylinositol (GPI), das in seiner freien Form als mögliches Toxin in der schweren Form der Malaria identifiziert wurde. Glycokonjugatimpfstoffe die Antikörper gegen GPI induzieren, sollten diesen toxischen Effekt der GPI’s neutralisieren oder zumindest abschwächen und somit die Entzündungseffekte reduzieren. In dieser Arbeit habe ich die immunogenen Eigenschaften verschiedener synthetischer GPI-Kohlenhydrat analysiert, um die Impfstoffentwicklung voran zu treiben. Hierfür wurden die Bindungseigenschaften verschiedener polyklonaler und monoklonaler Antikörper, die in mit synthetischen GPI-Derivaten geimpften Mausseren zu finden waren, mittels Mikroarrays bestimmt. Die Analyse zeigte auf, wie einzelne Strukturelemente der GPI-Kernstruktur die Spezifität der induzierten Antikörper beeinflusst. Auf Basis dieser Analyse konnten zwei optimierte synthetische Glykokonjugate, PetMan3 und PetMan4, entwickelt werden. Beide Strukturen zielten darauf ab, Antikörper mit einer Spezifität für das nicht reduzierte Ende der GPI-Kernstruktur zu bekommen, da diese Spezifität auch für Antikörper in Patienten mit schwerer Malaria gefunden wurde. Diese Antikörper sollten dann auch die Entzündungsreaktion des Körpers gegen die GPI-Struktur effektiv unterdrücken. Im Einklang mit meiner Hypothese, haben beide Strukturen reproduzierbar eine starke Immunantwort mit einhergehender Überproduktion von Antikörpern hervorgerufen. Wir konnten ebenfalls einen Antikörper des IgM-Typs mit einer Spezifität gegen PEtN Man3 als monoklonalen Antikörper rekombinant herstellen und in reinigen. Versuche einer aktiven Immunisierung mit den entwickelten Glykoknjugatimpfstoffen im Maus-Modell für experimentelle zerebrale Malaria zeigte jedoch keinen Effekt. Unsere entwickelten Impfstoffe führten reproduzierbar zu einer Th2-basierten Immunantwort, welche im Falle unseres Malariamodells die falsche ist und eine Aktivierung der Th1- basierten Immunantwort wünschenswert wäre. Daher sollten noch weitere Malariamodelle getestet werden, bei denen bekannt ist, dass eine Th2 basierte Immunantwort von Vorteil ist. Alternativ könnte ebenfalls durch Modifizierung der Glykokonjugatimpfstoffformulierung eine bessere Balance zwischen der TH1- und Th2-basierten Immunantwort erhalten werden, um so doch noch einen Impfschutz in dem von uns benutzten Mausmodell zu beobachten. Zufällig hat sich gezeigt, dass die hier erhaltenen Antikörper ebenfalls GPI-Strukturen des Parasiten L. mexicana erkennen. Daher ergibt sich die Möglichkeit die entwickelten Glykoknjugatimpfstoffe zur Immunisierun gegen andere durch Parasiten hervorgerufenen Krankheiten einzusetzten. Zusammengenommen zeige ich in meiner Arbeit, dass die Entwicklung von Kohlenhydrat basierten Impfstoffen durch gezielte Charakterisierung der Immunantwort gegen verschiedene strukturell verwandte Strukturen verbessert und beschleunigt werden kann. Dadurch können immunodominante Strukturen schnell und zuverlässig identifiziert werden. Gleichzeitig können in weiteren Schritten Impfstoffformulierungen bei minimalen Aufwand optimiert werden.
