Herpesviruses are important viral pathogens infecting human and animal populations worldwide. In the current study, we have investigated molecular mechanisms of equine herpesvirus type 1 (EHV-1) pathogenesis and characterized EHV-4 and elephant endotheliotropic herpesvirus type 1A (EEHV-1A) following disease outbreak in horses and elephants, respectively. To evaluate the role of viral proteins in cell-to-cell virus transfer between peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and endothelium, we have constructed EHV-1 (Ab4 strain) mutants after deleting open reading frame 1 (ORF1), ORF2 and ORF17 genes, either as single gene deletions or in combinations. Ab4 deletion mutants were analysed for replication properties, PBMC infection, cell-to-cell virus transfer between epithelium-PBMC and PBMC-endothelium, virus induced changes in PBMC proteome and cytokine/chemokine expression profiles. All deletion mutants were successfully reconstituted. ORF1, ORF2 and ORF17 genes are not essential for virus replication, and ORF17 deletion containing mutants showed significant reduction in plaque size. ORF2 and ORF17 were implicated in virus spread to the endothelium as evaluated by contact and flow chamber models; however, virus transfer from epithelial cells to PBMCs was not affected. Interestingly, all PBMC subpopulations including B lymphocytes, T lymphocytes and monocytes were able to transfer EHV-1 to EC. Ab4 infection in PBMC upregulated host proteins associated with endocytosis, Ras signaling, oxidative phosphorylation, platelet activation and leukocyte transendothelial migration, and downregulated chemokine signaling, herpesvirus infection, ribonucleic acid degradation and apoptotic pathways. Deletion of ORF1, ORF2 and ORF17 modulated chemokine signalling, mitogen activated protein kinase (MAPK) and herpesvirus infection pathways in infected PBMC. We presume that reduction in virus transfer from PBMC to endothelium may be attributed to modulation of host signaling and immune pathways. MAPK pathway is implicated in signal transduction, cell adhesion, cell survival and virus replication; Herpesvirus pathway is mediating receptor signaling, pro-inflammatory cytokine release, inhibition of apoptosis, nuclear factor-kappa B and antigen processing and presentation; Chemokine signaling is essential for activation of various immune pathways. Proteomic results were further confirmed by chemokine assay where Ab4 infection completely reduced the cytokine/chemokine release in infected PBMC and deletion of ORF1, ORF2 and ORF17 genes restored expression. Collectively, ORF2 and ORF17 genes essentially involved in virus spread to endothelium and along with ORF1 could stimulate strong cytokine/chemokine response. Therefore, these gene deletion mutants could be the potential target for development of live attenuated-vaccine. EHV-4 is enzootic in equine population. We have investigated a large outbreak of respiratory infection occurred in a group of in-housed foals and mares, at a Standardbred horse breeding farm in northern Germany. Virological assay revealed the involvement of EHV-4 in all the cases of respiratory illness as confirmed by virus isolation, quantitative-polymerase chain reaction and serological follow-up in paired serum sample using virus neutralization test and peptide-specific enzyme linked immunosorbent assay. Different restriction fragment length polymorphism profiles of the four isolates suggested the involvement of more than one animal as an index case of infection either due to primary infection or reactivation from latency. Epidemiological investigation revealed multifactorial causation as stress caused by seasonal changes, management practices, routine equestrian activities and exercise contributed in EHV-4 outbreak. Our study necessitates the stress alleviating measures and management practices in stud farm in order to avoid immuosuppression and disease outbreak. EEHV causes fatal hemorrhagic disease in young Asian elephants. Our investigation on two young Asian elephants died due to acute hemorrhagic disease revealed the involvement of EEHV-1A as a cause of the death. Widespread distribution of EEHV-1A was observed in various organs and tissues of the infected elephants. In hepatic endothelial cells, enveloped viral particles were accumulated within and around cytoplasmic electron-dense bodies. Virus isolation study in different cell cultures showed only limited virus replication; however, late viral protein expression was detected in infected cells. We have further demonstrated that glycoprotein B of EEHV-1A possesses a conserved cleavage site Arginine-X-Lysine/Arginine-Arginine that is targeted by the cellular protease furin, as like other members of the Herpesviridae. Through next-generation sequencing, we have determined the complete 180 kilobase pair genome sequence of EEHV-1A isolated from the liver. Though our virus isolation was unsuccessful, only little information is available regarding virus culture and the function of viral proteins. We have attempted to take an initial step in the development of appropriate cell culture system and virus characterization. Further, the complete genome sequence of EEHV-1A from our investigation will facilitate future studies on the epidemiology and diagnosis of EEHV infection in elephants. Taken together, our findings provide new insights into EHV-1 pathogenesis, especially molecular mechanisms of virus spread between PBMC and endothelium. Further our study with EHV-4 and EEHV-1A makes a significant contribution to existing knowledge and offers an important resource on herpesvirology.
Herpesviren sind wichtige virale Pathogene die sowohl Menschen als auch Tierpopulationen weltweit infizieren. In dieser Arbeit haben wir molekulare Mechanismen in der Equinen Herpesvirus Typ 1 (EHV-1) Pathogenese untersucht und EHV-4 und Elephant Endotheliotropic Herpes Virus Typ 1A (EEHV-1A) nach Krankheitsausbrüchen in Pferden bzw. Elefanten charakterisiert. Um die Rolle von viralen Proteinen im Virustransfer zwischen PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells; dt.: ‚mononukleäre Zellen des peripheren Blutes') und Endothel zu untersuchen, haben wir EHV-1 Mutanten(Stamm Ab4) mit Deletionen der Gene Open Reading Frame 1 (ORF1), ORF2 und ORF17 konstruiert, entweder als Einzelgen-Deletionsmutanten oder in Kombinationen. Die Ab4 Deletionsmutanten wurden auf Replikationsfähigkeit, PBMC-Infektivität, Zell-zu-Zell Transfer zwischen Epithel und PBMC bzw. PBMC und Endothel, virusinduzierte Veränderungen im PBMC-Proteom und die Zytokin/Chemokin Expressionsprofile hin untersucht. Alle Deletionsmutanten konnten erfolgreich rekonstituiert werden. Die Gene ORF1, ORF2 und ORF17 sind für die Virusreplikation nicht essenziellund die ORF17 Deletionsmutanten wiesen eine statistisch signifikante Reduktion der Plaque-Größen auf. ORF2 und ORF17 sind in der Virusverbreitung ins Endothel involviert, was durch Kontakt- und Durchflusskammer Modelle gezeigt werden konnte. Allerdings war die Virusverbreitung von Epithelzellen zu PBMC nicht beeinträchtigt. Interessanterweise waren alle PBMC Subpopulationen inkl. B- und T-Lymphozyten und Monozyten im Stande, EHV-1 auf Endothelzellen zu übertragen. Ab4 Infektionen von PBMC führte zur Hochregulierung von Wirtsproteinen welche mit Endozytose, der Ras Signalkaskade, oxidativer Phosphorylierung, Thrombozytenaktivierung und der transendothelialen Migration von Leukozyten assoziiert sind. Herunterreguliert wurde die Chemokin-Signalkaskade, Herpesvirusinfektion, Ribonukleinsäure Degradation und apoptotische Reaktionswege. Die Deletion von ORF1, ORF2 und ORF17 beeinflusste die Chemokin-Signalkaskade, MAP-Kinasen (MAPK; MAP, engl.: mitogen-activated protein) und Herpesvirusinfektions-Reaktionswege in infizierten PBMC. Wir vermuten, dass die Reduktion der Virusausbreitung von PBMC zum Endothel mit der Regulation von Wirtszell-Signalkaskaden und immunologischen Reaktionswegen zusammenhängt. Der MAPK-Reaktionsweg ist in Signaltransduktion, Zell-Adhäsion, Überleben von Zellen und Virusreplikation involviert. Der Herpesvirus-Reaktionsweg mediiert Rezeptor-Signalkaskaden, proinflammatorische Zytokinausschüttung, die Unterdrückung von Apoptose, sowie NF-κB und Antigenverarbeitung und -präsentation. Die Chemokin-Signalkaskade ist für die Aktivierung von zahlreichen immunologischen Reaktionswegen essenziell. Die Proteom-Ergebnisse wurden mittels Chemokin-Assays bestätigt, in denen Ab4 Infektionen die Zytokin-/Chemokinausschüttung in infizierten PBMC reduzierte, wobei die Deletion von ORF1, ORF2 und ORF17 die Genexpression wiederherstellte. Zusammenfassend sind die ORF2 und ORF17 Gene essenziell in die Virusausbreitung ins Endothel involviert und können zusammen mit ORF1 eine starke Zytokin-/Chemokinausschüttung stimulieren. Deswegen stellen diese Deletionsmutanten potenzielle Kandidaten für die Entwicklung von attenuierten Lebendimpfstoffen dar. EHV-4 ist in Pferdepopulationen endemisch. Wir haben einen großen Ausbruch von Infektionen des Respirationstraktes untersucht, der in einer Gruppe von Fohlen und Stuten auf einemGestüt in Norddeutschland aufgetreten ist. Virologische Untersuchungen zeigten die Beteiligung von EHV-4 in allen Fällen von Erkrankungen des Respirationstraktes, verifiziert durch Virusisolation, quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) und serologische follow-up-Untersuchungen per Virusneutralisationstest und peptidspezifischem Enzyme-linked Immunosorbent Assay. Verschiedene Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus-Profile von vier Isolaten lassen darauf schließen, dass mehr als ein Tier als Indexfall der Infektion verantwortlich sein könnten – entweder durch Primärinfektion oder Reaktivierung aus der Latenz. Epidemiologische Studien legten eine multifaktorielle Kausalität aus saisonbedingtem Stress und Stress durch Management, Routinebewegung und Training offen, die zum EHV-4-Ausbruch führte. Unsere Studie bestärkt die Wichtigkeit stresslindernder Maßnahmen und Managementpraktiken in Gestüten, um Immunsuppression und Krankheitsausbrüche zu vermeiden. EEHV ruft eine tödliche hämorrhagische Erkrankung in jungen asiatischen Elefanten hervor. Unsere Untersuchungen zweier asiatischer Elefanten, die an einer akut verlaufenden hämorrhagischen Krankheit verstorben sind, deckten EEHV-1A als Todesursache auf. Wir konnten eine weitverbreitete EEHV-1A-Infektion in verschiedene Organe und Gewebe der infizierten Elefanten beobachten. In Endothelzellen der Leber akkumulierten behüllte Viruspartikel, umgeben von zytoplasmatischen elektronendichten Einschlusskörperchen. Virusisolationen in verschiedenen Zellkulturen zeigte eine nur schwache Virusreplikation. Allerdings wurde die Expression von späten Virusproteinen in infizierten Zellen detektiert. Weiterhin konnten wir zeigen, dass Glykoprotein B (gB) von EEHV-1A eine konservierte Schnittstelle Arginin-X-Lysin/Arginin-Arginin besitzt die durch die zelluläre Protease Furin gespalten werden kann – wie andere Mitglieder der Herpesviridae. Mittels Next Generation Sequencing haben wir das komplette 180 Kilobasenpaare-Genom von aus der Leber isoliertem EEHV-1A bestimmt. Obwohl die Virusisolation nicht erfolgreich war ist zur Viruskultivierung und den Funktionen der viralen Proteine nur sehr wenig Information verfügbar. Wir haben versucht, einen initialen Schritt in der Entwicklung von geeigneten Zellkultursystemen und der Viruscharakterisierung zu gehen. Außerdem wird die komplette Genomsequenz eines EEHV-1A unserer Untersuchungen weitere Studien zur Epidemiologie und Diagnose von EEHV-1A -Infektionen in Elefanten erleichtern. Zusammenfassend bieten unsere Ergebnisse neue Einsichten in EHV-1 Pathogenese, speziell zu molekularen Mechanismen der Virusausbreitung von PBMC und Endothel. Des Weiterensind unsere Studien zu EHV-4 und EEHV-1A signifikante Beiträge zu bereits existierendem Wissen und bieten eine wichtige Ressource für die Herpesvirologie.
