Einleitung: Nach Rückenmarkstraumata kann die neuronale Regeneration durch Clostridium botulinum C3 Exoenzym (C3bot) und C3bot 26mer (ein von C3bot abgeleitetes Peptid) gefördert werden. Besondere Aufmerksamkeit gilt dabei C3bot 26mer, da es auch ohne enzymatische Aktivität weiterhin neuroregenerativ wirkt. In dieser Arbeit wurden die Effekte von C3bot und C3bot 26mer auf die neuronale EAAT3-vermittelte Glutamat-Aufnahme in der hippocampalen Zelllinie HT22 und in primären Hippocampus-Kulturen der Maus untersucht.
Methodik: HT22 Zellen und primäre hippocampale Neurone wurden drei Tage mit C3bot bzw. C3bot 26mer behandelt, bevor die [3H]-Glutamat-Aufnahme-Kapazität als Maß der Glutamat-Aufnahme aus dem Extrazellulärraum analysiert wurde. Immunfluoreszenz-, Western Blot und PCR- Analysen, sowie Biotinylierungs- und Immunpräzipitations-Studien dienten der Frage nach Ursachen veränderter Glutamat-Aufnahme-Kapazitäten unter C3 Proteinen.
Ergebnisse: C3bot 26mer führt zu einer verstärkten EAAT3-vermittelten Glutamat-Aufnahme in Hippocampusneuronen. Dieser Effekt beruht auf einer gesteigerten Phosphorylierung des Plasmamembran-ständigen Glutamattransporters EAAT3. Umgekehrt konnte bei der HT22 Zelllinie beobachtet werden: Eine reduzierte EAAT3-vermittelte Glutamat-Aufnahme ging mit einer reduzierten Phosphorylierung des Transporters und einem reduzierten Gehalt an EAAT3-mRNA einher. Des weiteren ließ sich feststellen, dass die beiden Zellkultursysteme Unterschiede in der Sensibilität gegenüber enzymkompetentem C3bot und enzymdefizientem C3bot 26mer zeigten: Während C3bot 26mer die Glutamat-Aufnahme-Kapazität in beiden Zelltypen beeinflusste, hatte es keine Wirkung auf Zellmorphologie und RhoA-Aktivität der HT22 Zelllinie.
Schlussfolgerung: Clostridium botulinum C3 Proteine könnten neben ihrem positiven Effekt auf das axonale Fortsatzwachstum auch durch Verstärkung der neuronalen Glutamat-Aufnahme-Kapazität die neuronale Regenerationsfähigkeit positiv beeinflussen. Beide Eigenschaften machen C3 Proteine zu vielversprechenden Werkzeugen in der Behandlung zentralnervöser Traumata.
Introduction: Clostridium botulinum C3 exoenzyme (C3bot) and C3bot 26mer (a C3bot-derived peptide) promote neuronal regeneration after spinal cord injury. Particular attention is paid to C3bot 26mer which, although lacking enzymatic activity, still promotes neuroregeneration. The present study investigates the effects of C3bot and C3bot 26mer on neuronal EAAT3-mediated glutamate uptake in the hippocampal cell line HT22 and in mouse primary hippocampal cultures.
Methods: HT22 cells and primary hippocampal neurons were treated with C3bot and C3bot 26mer for three days prior to analysis of [3H] -glutamate uptake capacity. Immunofluorescence, Western Blot, and PCR analyzes as well as biotinylation and immunoprecipitation studies were used to investigate the causes of altered glutamate uptake capacities after treatment with C3 proteins.
Results: This study shows that C3bot and C3bot 26mer increase phosphorylation of the glutamate transporter EAAT3 located in the plasmamembrane which mediates an increased EAAT3-mediated glutamate uptake in hippocampal neurons. Vice-versa we could observe a reduced EAAT3-mediated glutamate uptake accompanied by reduced transporter phosphorylation and reduced levels of EAAT3 mRNA in the HT22 cell line. Furthermore, the two cell culture systems showed differences in sensitivity to enzyme-competent C3bot and enzyme-deficient C3bot 26mer: while C3bot 26mer affected glutamate uptake capacity in both cell types, this peptide had no effect on cell morphology and activity of RhoA in the HT22 cell line.
Conclusion: Next to the known promoting of axonal outgrowth, Clostridium botulinum C3 proteins also could facilitate neuronal regeneration by enhancing glutamate uptake capacity of primary neurons. These properties make C3 Proteins promising tools for the treatment of lesions of the central nervous system.
